整合素β1與Kindlin-2在胃癌及癌前病變組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析*

（麗水市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

胃癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多階段、多因素、多通路的漸變過(guò)程，其中整合素在細(xì)胞異常增殖、胞外基質(zhì)降解，新生血管生成等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。有研究顯示，整合素β1 在正常狀態(tài)下多處于低親和力狀態(tài)，但是在多種腫瘤組織中表達(dá)量升高[2]。也有體外研究證實(shí)，整合素β1 可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞間的黏附作用，參與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程[3]。但是目前關(guān)于整合素β1 在胃癌發(fā)生中的激活機(jī)制尚不明確。Kindlin-2 蛋白屬于一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的整合素活化蛋白，可特異性結(jié)合整合素β1 受體，破壞α、β亞基間的鹽鍵，促進(jìn)整合素激活，影響細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控[4]。其癌變的發(fā)生機(jī)制一直是腫瘤領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，對(duì)臨床早期篩查和個(gè)體化治療具有重要的實(shí)踐意義。本研究選取慢性胃炎、胃癌癌前病變及胃癌患者作為受試對(duì)象，調(diào)查Kindlin-2 和整合素β1 在胃癌發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，從而為尋找用于早期胃癌診斷以及臨床進(jìn)展監(jiān)測(cè)的相關(guān)循環(huán)生物標(biāo)志物提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2019年1月在麗水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科、腫瘤科就診的80 例胃癌、80 例癌前病變及50 例慢性非萎縮性胃炎患者分別作為胃癌組、癌前病變組和胃炎組。胃癌組男性42 例，女性38例；年齡24～75 歲，中位年齡56 歲，平均（59.84±13.50）歲。癌前病變組男性55 例，女性25 例；年齡18～82 歲，中位年齡55 歲，平均（57.46±13.78）歲。胃炎組男性31 例，女性19 例，年齡18～72 歲，中位年齡54 歲，平均（55.44±12.63）歲。癌前病變組經(jīng)病理診斷，35 例患者為慢性萎縮性胃炎伴腸型化生，24 例患者為慢性萎縮性胃炎伴輕度異型增生，15 例患者為慢性萎縮性胃炎伴中度異型增生，6 例患者為慢性萎縮性胃炎伴重度異型增生。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)、內(nèi)鏡病理學(xué)檢查確診為胃癌、癌前病變或者慢性非萎縮性胃炎；②胃癌前病變患者為慢性萎縮性胃炎伴有腸上皮化生、異型增生；③既往未接受過(guò)任何抗癌治療；④簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有胃癌家族遺傳病史；②有嚴(yán)重心臟病病史或肝、腎功能不全；③合并其他惡性腫瘤。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。3 組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人整合素β1 單克隆抗體（ab52971，美國(guó)Abcam 公司），鼠抗人Kindlin-2 單克隆抗體（MAB2617，美國(guó)Millipore 公司）。免疫組織化學(xué)試劑盒（PV-9000，北京中山金橋生物科技有限公司），DAB 辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑（P0202，上海碧云天生物科技有限公司）。全自動(dòng)型石蠟切片機(jī)（德國(guó)SLEE 公司），BX60 光學(xué)倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），TK-C1381 圖像采集系統(tǒng)（日本JVC 公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

取石蠟塊連續(xù)切片，烘烤后常規(guī)滴加二甲苯脫蠟，并用梯度酒精溶液浸泡；滴加檸檬酸枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行組織抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。滴加整合素β1 單克隆抗體或Kindlin-2 單克隆抗體，以PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜。滴加二抗，DAB染色5～7 min，用自來(lái)水沖洗后終止染色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，加入鹽酸水溶液分化，水洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

由麗水市人民醫(yī)院病理科2 位主治醫(yī)生進(jìn)行雙盲法閱片。整合素β1 著色部位主要是細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，Kindlin-2 著色部位主要是細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)染色強(qiáng)度，從無(wú)、淡黃色、棕黃色及深褐色分別記為0、1、2 和3 分。另外根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，從0%、≤10%、＞10%～50%、＞50%～75%及＞75%染色細(xì)胞分別記為0、1、2、3 和4 分。染色指數(shù)=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，若染色指數(shù)≥2 則視為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)或χ2趨勢(shì)檢驗(yàn)，進(jìn)一步的兩兩比較用χ2分割法；兩變量相關(guān)分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組臨床資料比較

3 組年齡、性別及不同發(fā)病部位等臨床資料比較，經(jīng)方差分析或χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 組臨床資料比較

2.2 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)比較

3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較，經(jīng)χ2趨勢(shì)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，經(jīng)χ2分割法檢驗(yàn)，癌前病變組與胃癌組整合素β1和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于胃炎組（χ2=6.598和34.667，P=0.010 和0.000），且胃癌組整合素β1和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率亦高于癌前病變組（χ2=18.576，P=0.000）。見(jiàn)表2和圖1。

表2 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較例（%）

圖1 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)情況 （免疫組織化學(xué)染色）

2.3 3 組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 秩相關(guān)性檢驗(yàn)，胃炎組與癌前病變組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；而胃癌組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 癌前病變組Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

癌前病變組不同年齡、性別、發(fā)病部位及病理類(lèi)型患者的整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 胃癌組Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

胃癌組不同浸潤(rùn)深度、臨床病理分期、腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的整合素β1 陽(yáng)性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胃癌組不同腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床病理分期、腫瘤直徑及血管侵襲患者的Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表3 3 組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 例

表4 癌前病變組臨床病理因素與整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)的關(guān)系 例（%）

表5 胃癌組臨床病理因素與Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)的關(guān)系 例（%）

續(xù)表5

3 討論

在我國(guó)，早期胃癌的確診率較低，一方面與胃癌發(fā)病隱匿、早期癥狀不典型有關(guān)[5]；另一方面也與我國(guó)胃癌篩查普及不理想有關(guān)[6]。從發(fā)病機(jī)制角度出發(fā)，篩選、發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物對(duì)提高早期胃癌的診斷率和臨床個(gè)體化治療具有重要的臨床價(jià)值。

整合素是細(xì)胞表面重要的黏附分子，通過(guò)α、β非共價(jià)鍵連接形成異二聚體跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-胞外基質(zhì)間的黏附作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化及遷移等生物學(xué)過(guò)程。不同腫瘤細(xì)胞表面整合素受體類(lèi)型也存在一定的差異[7]，例如在胃癌組織中，整合素α3β1 表達(dá)明顯增加[8]。由于整合素受體亞型眾多，因此本實(shí)驗(yàn)選取整合素β1 作為研究重點(diǎn)。在正常生理狀態(tài)下，整合素β1 需要在活化蛋白的輔助下激活后與胞外基質(zhì)配體結(jié)合形成黏附結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步募集α-Catenin、Talin 等黏附分子并連接細(xì)胞骨架，可介導(dǎo)雙向信號(hào)通路激活，以維持細(xì)胞增殖-凋亡平衡。DONG 等[9]學(xué)者證實(shí)，整合素α3 β1 通過(guò)介導(dǎo)ERK1/2 信號(hào)通路激活，從而維持腫瘤干細(xì)胞表型，促進(jìn)胃癌的發(fā)生。整合素屬于T、B 淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的胃腸道炎癥關(guān)鍵介質(zhì)，可促使免疫細(xì)胞被選擇性招募到炎癥部位，參與胃腸道黏膜的炎癥反應(yīng)。張青松等[10]學(xué)者通過(guò)在Mass ARRAY 平臺(tái)上篩選，發(fā)現(xiàn)整合素存在6 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中ITGA1rs2447867 與非賁門(mén)癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。在我國(guó)，消化道潰瘍、慢性胃炎都屬于非賁門(mén)癌的重要危險(xiǎn)因素，因此整合素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在非賁門(mén)癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。既往多數(shù)研究只是證實(shí)，整合素在胃癌早期轉(zhuǎn)移以及化療耐藥中發(fā)揮著重要作用[11-13]，但在本研究中通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)整合素β1 在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于胃炎和癌前病變組織，推斷整合素也可能與胃癌癌變的發(fā)生有一定的關(guān)系。

另外，Kindlin 黏著斑白蛋白屬于整合素活化蛋白，通過(guò)與整合素β 亞基胞內(nèi)尾段結(jié)合增加整合素與胞外基質(zhì)的親和力，進(jìn)而激活下游一系列信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子等，參與細(xì)胞癌變的發(fā)生[14]。ZHAO 等[15]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Kindlin-2 蛋白表達(dá)后，可促使乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M 期，從而增加其增殖活性；而且在乳腺浸潤(rùn)性微乳頭狀癌（invasive micropapillary carcinoma,IMPC）組織中Kindlin-2 表達(dá)量與整合素β1 具有一定的正相關(guān)性，兩者均與IMPC 極性倒轉(zhuǎn)、集團(tuán)性侵襲和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。本研究中也發(fā)現(xiàn)整合素β1 和Kindlin-2 在癌前病變和胃癌組織中的表達(dá)顯著高于胃炎組織，說(shuō)明在胃癌早期就可以檢測(cè)到兩者表達(dá)異常，并且隨著胃癌惡性化程度的加重，Kindlin-2 蛋白和整合素β1 的表達(dá)都隨之增加。但是筆者分析上述兩者與癌前病變患者臨床病理因素的關(guān)系時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性；而且在胃炎患者和胃癌癌前病變患者中，Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)和整合素β1 的陽(yáng)性表達(dá)并未表現(xiàn)出正相關(guān)性。但是在胃癌患者中，兩者陽(yáng)性表達(dá)呈顯著的正相關(guān)：一方面可能是由于納入的樣本量偏少；另一方面推測(cè)Kindlin-2蛋白和整合素β1 是參與胃癌癌前病變向胃癌進(jìn)展的重要分子，兩者在胃癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用，在進(jìn)入胃癌發(fā)展階段后，Kindlin-2 可激活整合素β1，并增加整合素β1 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性蛋白等配體的親和力，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。

綜上所述，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白在胃炎、癌前病變和胃癌組織中的表達(dá)逐漸升高，推測(cè)可能與胃癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。而且隨著胃癌患者惡性化程度的加重，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸升高，與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床病理分期及腫瘤直徑等臨床病理因素有關(guān)。近年來(lái)分子靶向治療是胃癌研究的熱點(diǎn)，本研究證實(shí)整合素β1 和Kindlin-2 蛋白有望成為胃癌早期診斷和個(gè)體化治療的潛在靶點(diǎn)，并且為肺癌發(fā)病機(jī)制的研究、靶向藥物的研發(fā)提供了新的思路。