蟲(chóng)草花總黃酮，總氨基酸含量測(cè)定及其抗氧化活性研究*

羅 丹，姜 敏，李柯翱，田樹(shù)革

（1.新疆師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆奇沐醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830013）

蟲(chóng)草花屬于真菌門(mén)，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲(chóng)草屬，是由子座即草部分與菌核即蟲(chóng)的尸體部分兩部分組成的復(fù)合體。其性味甘溫，入肺腎經(jīng)，有補(bǔ)肺腎、止喘嗽、益虛損、扶精氣之功，適用于肺腎兩虛，精氣不足，咳嗽短氣，自汗盜汗，腰膝酸軟，是一種藥食同源的菌類[1,2]。蟲(chóng)草花是運(yùn)用現(xiàn)代科技人工培育出來(lái)的可供人們食用的菌類新品種，市面上又稱為蛹蟲(chóng)草，北冬蟲(chóng)夏草，蟬花等。蟲(chóng)草花的培養(yǎng)基是包含了天然蟲(chóng)草花生長(zhǎng)發(fā)育所含的各種養(yǎng)分，包括谷物類、豆類、蛋奶類等[3,4]。蟲(chóng)草花中主要化學(xué)成分有氨基酸類，黃酮類，多糖類和核苷酸蟲(chóng)草素等，具有抗腫瘤，抗炎鎮(zhèn)痛，抑菌抗感染，免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[5-10]。

本文以4 個(gè)不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花為對(duì)象，對(duì)其總黃酮、總氨基酸進(jìn)行含量測(cè)定，探究不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花之間的品質(zhì)差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為蟲(chóng)草花進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)的化學(xué)成分含量參考，并對(duì)蟲(chóng)草花提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為食用菌的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

K0-5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；AL-04 型電子天平（德國(guó)梅特勒托利多儀器有限公司）；UV-2700 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥及樣品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào):100080-200707，中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào):20100504，安徽宏通生物工程有限公司）；DPPH（批號(hào):217-591-8，東京化工產(chǎn)業(yè)）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、茚三酮等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水。

蟲(chóng)草花分別選自4 個(gè)產(chǎn)地，分別為新疆，云南，內(nèi)蒙古，遼寧，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為麥角菌科，蟲(chóng)草屬。

1.3 樣品溶液的制備

總黃酮的提取 分別稱取4 個(gè)不同產(chǎn)地的蟲(chóng)草花粉末2.00g 置于圓底燒瓶中，料液比1∶10，60%乙醇回流提取1.5h，重復(fù)兩次，過(guò)濾，合并濾液，密封保存?zhèn)溆肹11]。

總氨基酸的提取 分別稱取4 個(gè)產(chǎn)地蟲(chóng)草花粉末各2.00g 置于圓底燒瓶中，料液比1∶10，加入65%乙醇回流提取2h，重復(fù)兩次，過(guò)濾，合并濾液，密封保存?zhèn)溆肹12]。

1.4 對(duì)照品溶液的制備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取5.00mg 蘆丁對(duì)照品在50mL 容量瓶并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為0.1mg·mL-1的對(duì)照品溶液，存于4℃冰箱保存。

精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液:準(zhǔn)確稱取10.00mg 蘆丁對(duì)照品在10mL 容量瓶并用水稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為1mg·mL-1的對(duì)照品溶液，存于4℃冰箱保存。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

1.5.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]并做適當(dāng)修改，精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL，分別置于5 個(gè)10mL 具塞試管中，每管加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，充分搖勻，放置6min，加入0.3mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min，最后加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，并用蒸餾水補(bǔ)足至刻度，搖勻，室溫放置15min，以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液代替品標(biāo)準(zhǔn)品溶液做空白對(duì)照，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)510nm 處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度下測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照文獻(xiàn)[12]并做適當(dāng)修改, 精密吸取 0.02、0.03、0.04、0.05 和 0.06mL精氨酸對(duì)照品溶液于5 支10mL 的試管中，分別加入1mL 2% 茚三酮溶液，pH 值為6.8 Na2HPO4緩沖溶液1.0mL，加蒸餾水定容至5mL，混勻，90℃水浴15min 后取出冷卻至室溫，以不含精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的溶液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對(duì)照，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)570nm 處測(cè)定吸光度，以精氨酸對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度下測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 方法學(xué)考察

參考文獻(xiàn)[11,12]方法，取同一份標(biāo)準(zhǔn)品平行6份，在對(duì)應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，考察實(shí)驗(yàn)精密度；同一份標(biāo)準(zhǔn)品每隔15min 測(cè)定90min 內(nèi)的吸光度值，考察實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性；同一批次樣品平行6 份分別測(cè)定其吸光度，考察實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；平行稱取樣品6份，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品，按照對(duì)應(yīng)方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出回收率和RSD 值，考察實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收率。

1.7 樣品含量的測(cè)定

依次量取適當(dāng)?shù)南x(chóng)草花提取液，根據(jù)1.5.1 和1.5.2 的方法在對(duì)應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程得出樣品溶液中總黃酮的濃度，計(jì)算出4 個(gè)不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花中總黃酮、總氨基酸的含量。

1.8 蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 自由基的清除實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13-15]并做改動(dòng)，將蒸干的蟲(chóng)草花提取物依次稀釋得到 0.4、0.32、0.28、0.4、0.2、0.016、0.08mg·mL-1濃度的溶液。樣品組:將2mL 樣品溶液及2mL 1.0×10-4DPPH 加入同一試管中，搖勻，室溫下暗處?kù)o置30min 后在517nm 處測(cè)定吸光度（A1）；空白組:同時(shí)測(cè)定2mL DPPH 溶液與2mL 蒸餾水混合后的吸光度（A2）；空白對(duì)照:測(cè)定2mL 樣品溶液與2mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度（A3）。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)3 次。

清除率%=[1-（A1-A3）/A2]×100%

1.9 蟲(chóng)草花提取物對(duì)超氧陰離子的清除實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13-15]并做改動(dòng)，將蒸干的蟲(chóng)草花提取物依次稀釋得到 0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1mg·mL-1濃度的溶液。A1:將 4.5mL 50mmol·L-1Tris-HCl 緩沖溶液加入試管中，25℃水浴20min，分別向試管中加入1mL 濃度梯度的樣品溶液和0.4mL 25mmol·L-1鄰苯三酚溶液，搖勻，25℃水浴 6min，加入 0.1mL 8mol·L-1的 HCl 終止反應(yīng)，在 320nm 處測(cè)定吸光度；A2:用同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液；A3:用同體積的蒸餾水代替樣品溶液。以VC 為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)3 次。

清除率%=[1-（A1-A2）/A3]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1.6 方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蟲(chóng)草花的總黃酮、總氨基酸含量測(cè)定中其RSD 分別為1.41%、1.15%，精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 適當(dāng)吸取蟲(chóng)草花樣品溶液，用1.6 方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值，在90min 里每隔15min 測(cè)定一次吸光度。結(jié)果顯示，總黃酮、總氨基酸的RSD 分別為0.39%、0.45%，表明其在90min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次蟲(chóng)草花樣品6份，適當(dāng)吸取蟲(chóng)草花樣品溶液，用1.6 方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蟲(chóng)草花的總黃酮、總氨基酸的RSD 分別為0.24%、0.30%，重復(fù)性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率（表2）

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Experimental results of sample recovery rate（n=6）

由表2 可知，總黃酮、總氨基酸的加標(biāo)回收率分別為:（100.41±0.56）%，（101.67±0.48）%，RSD 均小于2%，說(shuō)明方法穩(wěn)定可行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 樣品含量測(cè)定

表3 不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花總黃酮、總氨基酸含量（n=3）Tab.3 Total flavonoids, total amino acid content of Cordyceps flowers from different areas（n=3）

從表3 可以看出，蟲(chóng)草花總黃酮含量新疆地區(qū)最高為 5.36mg·mL-1，云南地區(qū)最低為 3.98mg·mL-1，遼寧和內(nèi)蒙古蟲(chóng)草花總黃酮含量差別不大；蟲(chóng)草花總氨基酸含量云南地區(qū)最高為21.88mg·mL-1，遼寧地區(qū)最低為18.99mg·mL-1，新疆，內(nèi)蒙古地區(qū)蟲(chóng)草花總氨基酸含量差別不大。

2.4 蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 的清除作用

按照1.8 實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 的清除作用，建立清除率-濃度曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 的清除作用Fig.1 Effect of Cordyceps Flower on DPPH

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍之內(nèi)，4 個(gè)產(chǎn)地蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率隨著濃度的增加而升高，具有一定的量效關(guān)系。蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用，新疆產(chǎn)地的蟲(chóng)草花提取物對(duì)DPPH 的清除作用相較于其他3 個(gè)產(chǎn)地清除作用明顯。

2.5 蟲(chóng)草花提取物對(duì)超氧陰離子的清除實(shí)驗(yàn)

按照1.9 實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花提取物對(duì)超氧陰離子的清除作用，建立清除率-濃度曲線，見(jiàn)圖2。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍之內(nèi)，蟲(chóng)草花提取物對(duì)超氧陰離子的清除率隨著濃度的增加而升高，具有一定的量效關(guān)系。新疆地區(qū)蟲(chóng)草花提取物對(duì)超氧陰離子清除作用相較于其他3 個(gè)地區(qū)清除作用明顯。

3 結(jié)論

蟲(chóng)草花具有治療肺腎兩虛，咳嗽短氣，精氣不足，自汗盜汗等功效，其資源豐富，開(kāi)發(fā)前景良好，值得深入研究。本文中對(duì)4 個(gè)不同產(chǎn)地的蟲(chóng)草花進(jìn)行了總黃酮、總氨基酸含量測(cè)定并評(píng)價(jià)蟲(chóng)草花提取物的抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中方法學(xué)考察得出實(shí)驗(yàn)的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均在誤差允許范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。蟲(chóng)草花是一種人工培育的蟲(chóng)草子實(shí)體，其培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)技術(shù)、種質(zhì)資源質(zhì)量水平都會(huì)影響蟲(chóng)草花的品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同產(chǎn)地蟲(chóng)草花受氣候因素和人工培育技術(shù)影響其總黃酮、總氨基酸含量存在一定差異。同時(shí)從實(shí)驗(yàn)中可以看出，蟲(chóng)草花對(duì)DPPH 自由基、超氧陰離子兩種自由基具有一定的清除作用且清除率與濃度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，蟲(chóng)草花提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，蟲(chóng)草花作為一種藥食同源的的菌類，在保健食品中應(yīng)用廣泛，本文將為蟲(chóng)草花在抗氧化功能食品方面開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。