高尿酸血癥脾虛證病證結合大鼠模型的建立與評價初探

尚家駒，孫 淳，劉華一△

(1. 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津 300120； 2. 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津 300381)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙引起的代謝性疾病[1]。該病作為痛風的主要危險因素[2]，在中國有很高的患病率[3]。脾虛失運而致痰瘀內(nèi)生是高尿酸血癥臨床常見的中醫(yī)證候表現(xiàn)[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療本病尚存在不足[6]，雖已有一些隨機對照臨床試驗或系統(tǒng)評價[7-8]證明中醫(yī)藥治療對HUA有效，但其作用機制尚未完全闡明，仍需開展大量的動物實驗研究。因此，建立適宜的HUA與中醫(yī)證候相結合的動物模型，是開展中醫(yī)藥治療HUA作用機制研究的基礎和重點方向。目前已有的中醫(yī)藥治療HUA作用機制研究的動物實驗多采用單純高尿酸血癥動物模型[9]，但未同時模擬出中醫(yī)證候，與臨床中醫(yī)辨證論治HUA的實踐存在一定差距是此類單純疾病模型的缺陷。

本研究采用氧嗪酸鉀+高嘌呤肥甘厚味飼料喂養(yǎng)+小籠環(huán)境制備高尿酸血癥脾虛證病證結合大鼠模型，模型建立后，通過測量血清尿酸水平、外觀行為評分、血清D-木糖水平和力竭游泳時間等病證指標，對病證結合模型進行綜合評價，旨在建立一種可為中醫(yī)藥作用機制研究提供參考的疾病證候相結合的脾虛證高尿酸血癥大鼠模型。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，6周齡，體質量(200±10)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK(京)2014-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物房，飼養(yǎng)期間保持環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度(50±10)%，自然光暗周期，自由進食和飲水。本實驗已經(jīng)通過天津中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑

氧嗪酸鉀(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號C1808048)；D-木糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號E1605026)；尿酸(UA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20180906)；D-木糖檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20180908)。

1.3 儀器

電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司CPA)；低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠LDZ5-2)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；多功能微孔讀板機(PerkinElmer2390-0000)；紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司T6新世紀)。

2 方法

2.1 肥甘厚味、高嘌呤及高嘌呤肥甘厚味飼料的制備

參考前期造模經(jīng)驗制定飼料配方如下：肥甘厚味飼料配方為80%基礎飼料、10%豬油、10%全脂奶粉，高嘌飼料配方為80%基礎飼料、10%酵母、10%果糖，高嘌呤肥甘厚味飼料配方為60%基礎飼料、10%酵母、10%果糖、10%豬油、10%全脂奶粉，以上飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司加工制成。

2.2 分組

適應性喂養(yǎng)3 d后，將40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、脾虛證組(簡稱證組)、高尿酸血癥組(簡稱病組)、高尿酸血癥脾虛證病證結合組(簡稱病證結合組)，每組各10只。

2.3 高尿酸血癥脾虛證病證結合大鼠模型的建立

圖1示，采用“氧嗪酸鉀+高嘌呤肥甘厚味飼料喂養(yǎng)+小籠環(huán)境”多因素法進行造模：對照組、病組每5只大鼠置于R5型實驗鼠籠(535 mm×390 mm×200 mm)中飼養(yǎng)，證組、病證結合組每5只大鼠置于R3型實驗鼠籠(460 mm×300×180 mm)中飼養(yǎng)。1 d～28 d：對照組給予基礎飼料，病組給予高嘌呤飼料，證組給予肥甘厚味飼料，病證結合組給予高嘌呤肥甘厚味飼料。15 d～28 d：對照組、證組給予生理鹽水1 ml腹腔注射，病組、病證結合組給予氧嗪酸鉀混懸液1 ml腹腔注射，每日上午7時注射1次，連續(xù)14 d。

圖1 高尿酸血癥脾虛證病證結合大鼠模型造模方法示意圖

2.4 模型評價指標及方法

2.4.1 外觀行為及體質量觀測 表1示，每周三、六觀察記錄各組大鼠的外觀及行為變化，參考大鼠外觀行為評分標準[10]進行賦分，取1周內(nèi)2次分數(shù)的均值作為本周的外觀行為得分，每周日記錄各組大鼠體質量。

表1 大鼠外觀行為評分標準

2.4.2 血清尿酸及D-木糖含量測定 21 d～28 d：全部大鼠于上午9時按1 ml/100 g劑量給予3% D-木糖溶液灌胃，上午10時乙醚麻醉，目內(nèi)眥取血。取血后室溫靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取上層血清，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用酶比色法測量血清尿酸含量，間苯三酚法測量血清D-木糖含量。

2.4.3 力竭游泳時間測定 20 d～27 d：將負重大鼠(于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體質量10%的鐵絲)置于水深50 cm、水溫20 ℃的水槽中游泳，以力竭即大鼠鼻尖沒入水面5 s為度，記錄所用時間。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 外觀行為

表2示，實驗期間對照組、病組大鼠外觀行為未見明顯變化。從造模第2周開始，證組、病證結合組大鼠逐漸出現(xiàn)活動減少、皮毛發(fā)黃少光澤、飲食減少、大便變軟等表現(xiàn)并持續(xù)至第4周造模結束。與對照組比較，證組、病證結合組的外觀行為積分自第2周開始增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示造模后，證組、病證結合組大鼠表現(xiàn)出中醫(yī)脾虛證的證候特征。

表2 大鼠外觀行為積分比較(分，

3.2 體質量

表3示，實驗期間對照組大鼠體質量逐漸增加，符合大鼠的生長規(guī)律，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，證組、病證結合組體質量自第2周均見降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示造模后，證組、病證結合組大鼠消化吸收能力下降，脾胃功能呈受損狀態(tài)。

表3 大鼠體質量比較

3.3 血清尿酸水平

表4示，與對照組比較，證組大鼠血清尿酸含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，病組、病證結合組血清尿酸含量均上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示造模后病組、病證結合組大鼠處于高尿酸血癥狀態(tài)。

3.4 血清D-木糖含量

表4示，與對照組比較，病組大鼠血清D-木糖含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，證組、病證結合組血清D-木糖含量均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示造模后證組、病證結合組大鼠的消化功能減弱，即脾虛而失于運化。

3.5 力竭游泳時間

表4示，與對照組比較，病組大鼠力竭游泳時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，證組、病證結合組力竭游泳時間均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示造模后證組、病證結合組大鼠的耐力下降，即脾氣虛。

表4 大鼠血清尿酸水平、血清D-木糖水平及力竭游泳時間比較

4 討論

高尿酸血癥疾病模型屢見不鮮[11]，但高尿酸血癥與中醫(yī)證候相結合的病證結合模型卻鮮見報道。中醫(yī)藥治療高尿酸血癥應從“證”入手，建立高尿酸血癥病證結合模型是從中醫(yī)臨床實際出發(fā)，以服務臨床實踐為目的的迫切需要。

4.1 高尿酸血癥模型的建立及評價

采用國際上制備高尿酸血癥模型普遍認可的氧嗪酸鉀[12](抑制尿酸分解)作為主要造模劑，根據(jù)文獻報道及前期造模經(jīng)驗輔以含有果糖[13]及酵母[14]的高嘌呤飼料(增加尿酸合成)建立高尿酸血癥模型，通過檢測大鼠血清尿酸水平評價造模是否成功。實驗結果表明，病組、病證結合組大鼠在高嘌呤飼料喂養(yǎng)4周的基礎上，于第3、4周聯(lián)合氧嗪酸鉀(200 mg/kg)連續(xù)腹腔注射2周，可使血尿酸達到較高水平且能維持1周。

4.2 脾虛證模型的建立及評價

物質生活水平的提升和精神壓力的增加促進了現(xiàn)代人過食肥甘厚味飲食方式及好逸少動生活方式的形成。而“太飽則脾阻，過逸則脾滯，脾氣困滯而少健運”(《溫熱經(jīng)緯·薛生白濕熱病篇》)，過食、過逸傷脾可形成脾虛之證。故基于過食過逸傷脾的中醫(yī)理論，采用肥甘厚味飼料模擬過食肥甘厚味的飲食方式、小籠環(huán)境模擬過逸少動的生活方式以制備中醫(yī)脾虛證模型。在模型評價方面，既通過制定量表對大鼠的外觀行為進行觀察評分以半定量地反映其中醫(yī)脾虛證候，又依據(jù)中醫(yī)“脾主身之肌肉”(《素問·痿論篇》)“勞則氣耗”(《素問·舉痛論篇》)理論，以力竭游泳時間[15]衡量大鼠脾氣虛的程度；同時采用公認的實驗室指標D-木糖水平客觀反映脾虛情況。本實驗觀察到，隨著造模時間的推移，證組、病證結合組大鼠體質量較對照組減輕，其外觀行為在造模第2周開始逐漸出現(xiàn)神疲乏力、形體消瘦、納少便溏、毛發(fā)枯黃等符合中醫(yī)脾虛證征象的變化，力竭游泳時間縮短及血清D-木糖水平下降，又從客觀指標方面提示大鼠脾虛證候的形成。

單純的脾虛證模型組血清尿酸水平無明顯變化，同時單純的高尿酸血癥疾病模型組的脾虛征象指標無明顯變化。與單純的疾病模型或證候模型比較，病證結合模型將現(xiàn)代醫(yī)學方法與中醫(yī)基礎理論相結合，能更好地同時體現(xiàn)西醫(yī)疾病與中醫(yī)證候的特點，且更符合臨床實際。目前高尿酸血癥中醫(yī)證候動物模型的研究及報道尚少。本次實驗的病證結合模型造模采用中醫(yī)病因模型加西醫(yī)病理模型聯(lián)合造模，建立的高尿酸血癥脾虛證病證結合模型既具有高尿酸血癥尿酸水平升高的疾病特征，又具備脾虛證的證候并提示脾虛證的陽性實驗室指標，適用于臨床診斷為高尿酸血癥且中醫(yī)辨證證屬脾虛患者的中醫(yī)藥治療機制研究。本次實驗在病證結合高尿酸血癥動物模型制備方面進行了初步探索，模型的成功建立對于中藥藥效評價和中藥作用機理研究具有一定意義，能更好地為臨床診療服務。

實際臨床中，脾虛證患者多表現(xiàn)為慢性病程，提示脾虛證的形成是一個較長期的過程。本次實驗造模時間為4周相對較短，未來可適當延長造模時間并進行觀察總結。本次實驗尚缺乏藥物的反證，接下來或可增加以方測證的方法，以驗證制備模型中醫(yī)證候的準確性。本研究是從病與證兩方面分別造模最終組合而成的病證結合模型，今后應尋找能同時制備病與證的造模方法，以優(yōu)化造模過程。