螯合劑對(duì)桑苗修復(fù)Cd、Pb復(fù)合污染土壤的影響

蔣詩(shī)夢(mèng) 黃仁志 蔣勇兵 賈超華 秦志雄

(湖南省蠶桑科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410127)

桑樹(shù)作為污染耕地替代種植的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)重金屬有一定的耐受性，其地上部分對(duì)鎘(Cd)、鉛(Pb)的富集系數(shù)小于1，富集能力有限[1]，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在土壤中添加螯合劑可以促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收，提高其對(duì)重金屬的富集轉(zhuǎn)移效率[2]，且不同螯合劑對(duì)同一種重金屬增溶效果不同，同一種螯合劑對(duì)不同金屬離子的螯合能力也不相同[3]。螯合劑在誘導(dǎo)植物修復(fù)污染土壤的過(guò)程中對(duì)植物生長(zhǎng)的影響包括低濃度的螯合劑能促進(jìn)鬼針草[4]、商陸[5]的生長(zhǎng)，隨著螯合劑添加濃度的增加，玉米、苧麻中的重金屬含量會(huì)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)[6-7]，同時(shí)過(guò)高濃度的螯合劑又會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[8-9]。目前，螯合劑對(duì)桑樹(shù)修復(fù)重金屬污染土壤的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)開(kāi)展盆栽試驗(yàn)，分別添加活化能力強(qiáng)-衰減緩慢型的螯合劑乙二胺四乙酸(C10H16N2O8，EDTA)、中等活化能力-衰減顯著型的二乙烯三胺五乙酸(C14H23N3O10，DTPA)、低活化能力型的檸檬酸(C6H8O7·H2O，CA)[10]來(lái)探討螯合劑添加種類、濃度對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)及土壤中Cd、Pb含量的影響，旨在篩選出在污染耕地中適合與桑樹(shù)聯(lián)合使用的螯合劑，為桑樹(shù)修復(fù)土壤重金屬污染的應(yīng)用技術(shù)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤和桑苗 供試土壤取自湘西洞口縣花園鎮(zhèn)寶萬(wàn)村的污染土壤，Cd含量為11.81±0.58 mg/kg，Pb含量為418.90±55.49 mg/kg，Cd、Pb含量分別為GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[11]中各自自然背景的59倍和12倍。試驗(yàn)用的桑苗為農(nóng)桑14號(hào)的實(shí)生苗，購(gòu)自射陽(yáng)縣恒威蠶業(yè)專業(yè)合作社。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑與儀器 EDTA、DTPA、CA、丙酮均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；PBS磷酸鹽緩沖液，購(gòu)自上海瑞楚生物科技有限公司；蛋白檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化物酶(POD)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盆栽處理 將供試土壤拌好裝入盆中，每盆裝土12 kg，然后分別添加螯合劑EDTA、DTPA、CA，每種螯合劑分別設(shè)置低濃度(1.00 mmol/kg)、中濃度(5.00 mmol/kg)、高濃度(10.00 mmol/kg)和空白對(duì)照(CK)4組處理，每組處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)36盆。每盆栽植1株桑苗，栽植后整形剪枝，每枝留3～4個(gè)芽苞，從3月至10月，做好盆栽苗的日常管理，定期澆水、施肥、松土。

1.2.2 桑苗生長(zhǎng)狀況調(diào)查 7月中旬，統(tǒng)計(jì)每組盆栽桑苗的枝條總數(shù)，測(cè)量桑苗枝條長(zhǎng)度、葉片數(shù)及最大葉幅，根據(jù)以上數(shù)值衡量桑苗的生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 葉綠素含量測(cè)定 9月中旬，在最終取樣前，用內(nèi)徑為13 mm的不銹鋼打孔器切取桑苗頂部的葉片，放入80%的丙酮溶液中過(guò)夜后提取葉綠素，分別用752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取液的645 nm和663 nm的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量：葉綠素含量(mg/dm2)=[0.5(20.29A+8.05A1)]/S，式中的A為645 nm吸光度值，A1為663 nm吸光度值，S為內(nèi)徑13 mm的打孔器切取的葉片面積。

1.2.4 抗氧化酶活性測(cè)定及MDA含量測(cè)定 10月最終取樣時(shí)，準(zhǔn)確稱取葉片質(zhì)量，按葉片質(zhì)量(g)∶磷酸鹽緩沖液體積(mL)=1∶9的比例，加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，冰浴研磨，3 500 r/min離心10 min，取上清液制成10%的組織勻漿。取10%的組織勻漿，按照蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟檢測(cè)葉片樣品中的蛋白濃度后，再分別用試劑盒檢測(cè)并計(jì)算葉片樣品中T-SOD、POD、CAT酶的活性及葉片中MDA的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 螯合劑種類及添加濃度對(duì)桑苗生長(zhǎng)的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗的枝條總數(shù)、枝條長(zhǎng)度、葉片數(shù)及葉片最大葉幅的影響情況(表1)可以看出：整個(gè)生長(zhǎng)周期中，添加不同濃度CA的桑苗長(zhǎng)勢(shì)均較好，添加中濃度、高濃度EDTA和高濃度DTPA的桑苗長(zhǎng)勢(shì)較差，葉片過(guò)早出現(xiàn)掉落、黃化、止芯的現(xiàn)象；隨著螯合劑添加濃度的升高，桑苗枝條總數(shù)、葉片最大葉幅總體呈下降的趨勢(shì)。另外，桑苗枝條長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：添加不同濃度的CA對(duì)枝條長(zhǎng)度無(wú)顯著影響，而添加中濃度、高濃度的DTPA和EDTA可使枝條長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照組；添加不同濃度的DTPA和CA對(duì)桑苗葉片數(shù)無(wú)顯著影響，而添加高濃度的EDTA使桑苗葉片數(shù)顯著低于對(duì)照組(表1)。

表1 不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗的枝條總數(shù)、枝條長(zhǎng)度、葉片數(shù)及葉片最大葉幅的影響情況

2.2 螯合劑種類及添加濃度對(duì)桑苗葉片中葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗的葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況(表2)可以看出，添加不同濃度的CA對(duì)桑苗葉片的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性及MDA含量均無(wú)顯著影響，添加低濃度的EDTA對(duì)桑苗葉片的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性及MDA含量也無(wú)顯著影響；添加不同濃度的DTPA對(duì)桑苗葉片的SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量無(wú)顯著影響，添加低濃度、中濃度的DTPA對(duì)桑苗葉片的葉綠素含量無(wú)顯著影響，但添加中濃度、高濃度的DTPA使葉片蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組，添加高濃度的DTPA使桑苗葉片POD酶活性顯著高于對(duì)照組。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，添加中濃度、高濃度EDTA的桑苗出現(xiàn)接連死亡的情況，導(dǎo)致樣品不足，所有數(shù)據(jù)均缺失。

表2 不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗的葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況

2.3 螯合劑種類及添加濃度對(duì)桑苗根部土壤與桑苗根部Cd、Pb含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Cd含量的影響情況(表3)可以看出：添加不同濃度的CA對(duì)桑苗根部土壤Cd含量無(wú)顯著影響；但添加DTPA、EDTA對(duì)桑苗根部土壤中的Cd含量有顯著影響，其中添加中濃度、高濃度的DTPA和高濃度的EDTA均使桑苗根部土壤Cd含量顯著低于對(duì)照組。從表3還可以看出，隨著添加螯合劑濃度的增加，桑苗根部Cd含量值會(huì)出現(xiàn)差異，但統(tǒng)計(jì)分析表明差異并未達(dá)到顯著水平。

表3 不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Cd含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Pb含量的影響情況(表4)可以看出：添加不同濃度的CA對(duì)桑苗根部土壤Pb含量無(wú)顯著影響；但添加DTPA、EDTA對(duì)盆栽桑苗根部土壤Pb含量有顯著影響，其中添加中濃度的DTPA使桑苗根部土壤Pb含量顯著高于對(duì)照組，添加高濃度的EDTA使桑苗根部土壤Pb含量顯著低于對(duì)照組。添加3種不同的螯合劑，除了添加高濃度的DTPA使桑苗根部Pb含量顯著高于對(duì)照組外，其它螯合劑不同濃度處理的桑苗根部Pd含量均無(wú)顯著差異(表4)。

表4 不同螯合劑不同添加濃度對(duì)盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Pb含量的影響情況

3 小結(jié)與討論

隨著添加螯合劑濃度的升高，盆栽桑苗葉片的部分指標(biāo)與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，尤其是EDTA高濃度組最早出現(xiàn)桑苗止芯、死亡的現(xiàn)象，這表明高濃度的螯合劑會(huì)抑制桑苗的生長(zhǎng)。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，如有研究表明：隨著添加螯合劑[谷氨酸N，N-二乙酸(GLDA)、DTPA]時(shí)間的延長(zhǎng)(第16天)，在玉米中會(huì)出現(xiàn)螯合劑毒性導(dǎo)致生物量大幅下降，最后重金屬提取量增高不大甚至大幅下降的情況[10]；添加EDTA在促進(jìn)苧麻各部分Cd吸收的同時(shí)，也會(huì)對(duì)苧麻的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[12]；添加較高濃度(7.50 mmol/kg)的EDTA對(duì)棉花產(chǎn)生了毒害作用[13]。本文在此基礎(chǔ)上檢測(cè)了各組桑苗葉片中的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、MDA含量及抗氧化酶活性，植物通過(guò)抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)的變化來(lái)清除由重金屬脅迫造成的自由基失衡，不同螯合劑種類及添加濃度有不同的表現(xiàn)。有研究表明，添加EDTA前期(開(kāi)始10 d)，地被竹會(huì)通過(guò)增加SOD、POD、CAT酶活性和可溶性蛋白質(zhì)含量抵抗Pb脅迫[14]，EDTA的添加還能引起苧麻根系的CAT酶活性急劇下降[7]；此外，移栽50 d后，高濃度的EDTA會(huì)導(dǎo)致苧麻葉片中的MDA含量增加[15]。從本文數(shù)據(jù)中僅能看出添加EDTA、DTPA對(duì)重金屬污染土壤中栽植的桑苗生長(zhǎng)存在影響，如顯著降低了桑苗的枝條長(zhǎng)度，但桑苗葉片的葉綠素含量、SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量等均未體現(xiàn)出明顯差異，數(shù)據(jù)顯示，只有添加DTPA降低了葉片的蛋白質(zhì)含量，提高了葉片的POD酶活性。不能排除的是，由于試驗(yàn)周期設(shè)置太長(zhǎng)，導(dǎo)致以上指標(biāo)的變化未能通過(guò)及時(shí)檢測(cè)而明晰。

因?yàn)樘砑域蟿〥TPA與EDTA中濃度(5.00 mmol/kg)和高濃度(10.00 mmol/kg)處理組的桑苗先后出現(xiàn)止芯死亡的現(xiàn)象，桑葉掉落，致使整株桑苗Cd含量的數(shù)據(jù)不具代表性，所以通過(guò)最終分析桑苗根部土壤、桑苗根部Cd、Pb含量的變化來(lái)評(píng)判螯合劑對(duì)桑苗吸收重金屬Cd、Pb的影響。有文獻(xiàn)表明，隨著EDTA施用濃度的增加，土壤中Cd和Pb含量顯著降低[15]；施用EDTA處理根際土壤Cd含量與對(duì)照相比降低了25%[16]；但在栽植欒樹(shù)幼苗的盆栽中添加不同濃度的EDTA則發(fā)現(xiàn)，EDTA提高了土壤中重金屬的解吸能力，在添加90 d后，土壤Cd含量達(dá)到最高值，而360 d后土壤中的Pb含量才達(dá)到最高值，同時(shí)期土壤重金屬含量EDTA較低濃度處理(0.25 mmol/kg、0.50 mmol/kg)高于中低濃度處理(2.00 mmol/kg、4.00 mmol/kg)[17]。本文添加低濃度、中濃度的EDTA，土壤中的Cd、Pb含量與對(duì)照相比差異不顯著，而添加高濃度的EDTA可使根部土壤Cd、Pb含量顯著低于對(duì)照及低濃度、中濃度處理組數(shù)據(jù)，且添加不同濃度的EDTA對(duì)桑苗根部的Cd、Pb含量無(wú)顯著影響，推測(cè)添加高濃度的EDTA有利于土壤中Cd、Pb被桑苗吸收與向地上部分的轉(zhuǎn)移，從而對(duì)桑苗表現(xiàn)出了毒性。

本試驗(yàn)中，隨著添加DTPA濃度的增加，根部土壤中Cd含量下降，添加中濃度、高濃度DTPA的根部土壤Cd含量與對(duì)照相比達(dá)到了顯著水平，但桑苗根部的Cd含量沒(méi)有隨著添加DTPA濃度的增加而表現(xiàn)出顯著差異，推測(cè)中濃度、高濃度的DTPA有利于桑苗對(duì)Cd的吸收與Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移。桑苗根部土壤中的Pb含量隨著添加DTPA濃度的增加與對(duì)照相比出現(xiàn)了與Cd含量變化不同的趨勢(shì)，添加中濃度的DTPA顯著增加了根部土壤中的Pb含量，添加低濃度、高濃度的DTPA桑苗根部土壤中的Pb含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，推測(cè)添加中濃度的DTPA有利于土壤中的Pb聚集在桑苗根部，同時(shí)添加高濃度的DTPA時(shí)桑苗根部的Pb含量顯著高于對(duì)照組和添加低濃度、中濃度處理組的數(shù)據(jù)，推測(cè)添加高濃度的DTPA有利于桑苗根部對(duì)Pb的吸收。

添加CA可提高土壤質(zhì)量[18]，可以促進(jìn)苧麻生長(zhǎng)，增強(qiáng)苧麻對(duì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)移，但對(duì)Pb的吸收轉(zhuǎn)移效果不顯著[19]；也有研究表明CA能有效促進(jìn)Pb在魚(yú)腥草體內(nèi)向地上部分轉(zhuǎn)移，對(duì)Cd則表現(xiàn)出抑制作用[9]。但在本文中，添加不同濃度的CA對(duì)桑苗根部土壤Cd、Pb含量無(wú)顯著影響，對(duì)桑苗根部的Cd、Pb含量也無(wú)顯著影響。

本試驗(yàn)研究了不同種類、不同濃度螯合劑對(duì)土壤與桑苗Cd、Pb含量的影響，結(jié)果表明，除CA外，添加中濃度、高濃度的DTPA與高濃度的EDTA時(shí)，桑苗根部土壤中的Cd、Pb含量與對(duì)照相比變化顯著，但考慮添加高濃度的螯合劑會(huì)對(duì)桑苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性作用使桑苗死亡，在土壤中添加中濃度的DTPA或許是適合與桑樹(shù)聯(lián)合修復(fù)污染農(nóng)田的措施，這還需要后續(xù)試驗(yàn)加以驗(yàn)證，通過(guò)跟蹤監(jiān)測(cè)各數(shù)據(jù)，結(jié)合桑苗生長(zhǎng)的不同時(shí)期探索施加螯合劑發(fā)揮作用的最佳時(shí)間，也可考慮在桑苗生長(zhǎng)過(guò)程中分次添加低濃度的螯合劑，以降低螯合劑的毒性，最大限度地發(fā)揮螯合劑的作用。