稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性及兩者的協(xié)同作用

劉世江，趙琪君，丁 怡，李榮玉,3，李 明,3，吳小毛,3

(1.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 獼猴桃工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025； 3.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的真菌性病害，是水稻生產(chǎn)中三大病害之一，發(fā)生范圍廣泛，輕者導(dǎo)致減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)40%～50%，甚至絕收，嚴(yán)重制約水稻的品質(zhì)、產(chǎn)量[1-3]。防治稻瘟病的主要措施有種植抗病品種、采用合理的栽培管理措施、化學(xué)藥劑防治等，其中，化學(xué)防治具有經(jīng)濟(jì)、簡便、見效快等特點(diǎn)，起著不可替代的作用[4]。目前，用于防治稻瘟病的化學(xué)藥劑主要有稻瘟靈、異稻瘟凈、咪鮮胺、多菌靈、肟菌酯、春雷霉素、烯肟菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、三環(huán)唑和戊唑醇等[5]。一些化學(xué)藥劑由于長期單一使用，在一些地區(qū)已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降，如稻瘟靈、異稻瘟凈等藥劑都已產(chǎn)生抗性菌株[6]。

咪鮮胺(Prochloraz)屬于麥角甾醇生物合成抑制劑，對(duì)子囊菌和半知菌引起的真菌病害防治效果較好[7]，廣泛應(yīng)用于防治稻瘟病、稻曲病、水稻惡苗病等水稻病害[8]。三環(huán)唑(Tricyclazole)屬于黑色素合成抑制劑，具有高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)等特點(diǎn)，產(chǎn)生間接化合物作用于病原菌，被廣泛應(yīng)用于稻瘟病的防治[9]。隨著咪鮮胺和三環(huán)唑在稻瘟病防治上的廣泛使用，中國部分稻區(qū)出現(xiàn)三環(huán)唑防效下降的現(xiàn)象[10]，一些研究者對(duì)其敏感性進(jìn)行了研究，但稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感基線研究較少，僅鄭麗娜[11]、祁之秋等[12]分別建立了黑龍江省、遼寧省稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線，車淑靜[13]建立了黑龍江省稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感基線，而南方稻區(qū)則未見相關(guān)報(bào)道。為此，以2017年從南方及河南南部稻區(qū)分離得到的稻瘟病菌菌株為研究對(duì)象，采用菌絲生長速率法測定稻瘟病菌菌株對(duì)咪鮮胺的敏感性，采用水稻苗活體法測定稻瘟病菌菌株對(duì)三環(huán)唑的敏感性及咪鮮胺和三環(huán)唑的協(xié)同作用，建立稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感基線，分析不同地區(qū)稻瘟病菌的敏感性差異，為評(píng)估咪鮮胺、三環(huán)唑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)和科學(xué)施藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2017年從貴州省黃平縣(HP)、湄潭縣(MT)、貴安新區(qū)(GA)，湖北省武穴市(WX)、江夏區(qū)(JX)，湖南省長沙市(CS)，河南省信陽市(XY)7個(gè)市(縣、區(qū))稻區(qū)采集稻瘟病樣本，分離稻瘟病菌菌株。

1.1.2 供試藥劑及水稻品種 98%咪鮮胺原藥，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；95%三環(huán)唑原藥，江蘇耕耘化學(xué)有限公司生產(chǎn)；用丙酮配制成10 000 μg/mL母液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?5%三環(huán)唑可濕性粉劑(WP)，江西中訊農(nóng)化有限公司生產(chǎn)；45%咪鮮胺水乳劑(EW)，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司生產(chǎn)。水稻品種為大粒香，購自貴州省湄潭縣竹香米業(yè)有限責(zé)任公司，在人工氣候箱中用營養(yǎng)液培育水稻苗。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL；米糠培養(yǎng)基：米糠20 g，葡萄糖10 g，瓊脂10～15 g，去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌的分離、純化及保存 采用單孢分離法[14]，將發(fā)病組織沿病斑剪下(約1～2 cm)，乙醇消毒(30 s)后用無菌水沖洗，放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。將產(chǎn)生深灰色霉層的病斑放在顯微鏡下挑取單孢子，貼在培養(yǎng)基上，密封置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，長滿孢子后進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接至試管斜面，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 稻瘟病菌孢子懸浮液的制備 采用米糠培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢[15]，取培養(yǎng)好的稻瘟病菌接種到米糠培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d，將少量無菌水倒入長滿菌絲的培養(yǎng)皿中，用毛筆輕輕洗刷培養(yǎng)基表面。然后置于黑光燈(365 nm)下28 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基表面產(chǎn)生大量孢子后，倒入少量無菌水洗刷表面，過濾鏡檢，配制成所需要濃度的孢子懸浮液。

1.2.3 稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[16]。將咪鮮胺原藥母液配制成系列濃度梯度的稀釋液，按比例與PDA培養(yǎng)基混合，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，配制成含系列濃度咪鮮胺的PDA培養(yǎng)基平板。用直徑6 mm的打孔器切取稻瘟病菌菌餅，接種至含藥PDA培養(yǎng)基平板上，以不加藥劑為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，密封置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d。采用十字交叉法分別測量每個(gè)菌落的直徑，計(jì)算測量數(shù)據(jù)。

1.2.4 稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感性測定 參考張傳清等[17]的方法，測定稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感性。取培養(yǎng)至三葉一心的水稻苗，用系列濃度的三環(huán)唑原藥稀釋液噴霧處理，24 h后用培養(yǎng)好的孢子懸浮液噴霧接種處理好的水稻苗，置于人工氣候箱，100%保濕，黑暗培養(yǎng)36 h后，光暗交替，80%相對(duì)濕度，25 ℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，7 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.5 咪鮮胺與三環(huán)唑不同組合對(duì)稻瘟病菌的聯(lián)合作用測定 將咪鮮胺原藥與三環(huán)唑原藥按有效成分比為1∶20、2∶20、3∶20、4∶20、5∶20進(jìn)行組合，配制成系列濃度藥液進(jìn)行噴霧處理，具體方法參照1.2.4。

1.2.6 咪鮮胺與三環(huán)唑增效組合對(duì)稻瘟病的田間防效試驗(yàn) 根據(jù)1.2.5的試驗(yàn)結(jié)果，選擇增效顯著的組合咪鮮胺、三環(huán)唑組合(有效成分比4∶20，)進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。于2019年在貴州省黃平縣舊州鎮(zhèn)按照《農(nóng)藥 田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一) 殺菌劑防治水稻葉部病害》(GB/T 17980.19—2000)的方法進(jìn)行。試驗(yàn)地水肥充足、地勢平坦。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理：75%三環(huán)唑WP 330 g/hm2、45%咪鮮胺EW 360 g/hm2、45%咪鮮胺EW與75%三環(huán)唑WP組合(有效成分比4∶20)90 g/hm2、45%咪鮮胺EW與75%三環(huán)唑WP組合(4∶20)180 g/hm2、45%咪鮮胺EW與75%三環(huán)唑WP組合(4∶20)360 g/hm2、清水對(duì)照。每個(gè)處理4次重復(fù)，共24個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積30 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)之間設(shè)置30 cm保護(hù)行。分別于施藥后7、14、21 d調(diào)查記錄總株數(shù)、病株數(shù)和各病級(jí)數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)和防效。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到毒力回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)，計(jì)算咪鮮胺、三環(huán)唑?qū)Ω骶甑挠行б种浦袧舛?EC50)。利用SPSS 24對(duì)菌株EC50值進(jìn)行聚類分析。參考張蕊蕊等[18]的方法求組合共毒系數(shù)(CTC)，共毒系數(shù)<80為拮抗作用；介于80～120為相加作用；>120為增效作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性及敏感基線

從稻瘟病發(fā)病樣本上共分離純化得到103株稻瘟病菌菌株。由圖1可見，103株供試稻瘟病菌菌株對(duì)咪鮮胺的敏感性呈連續(xù)性分布(圖1)，EC50值介于0.004 2～0.056 μg/mL，均值為0.027 μg/mL。其中，敏感性較弱的稻瘟病菌菌株(貴安新區(qū)GA2)EC50值是敏感性較強(qiáng)菌株(信陽XY14)的13.33倍。在EC50值范圍內(nèi)，從0.004 0 μg/mL開始，設(shè)置組距為0.006 5 μg/mL，將其劃分為8個(gè)組，統(tǒng)計(jì)各組的菌株數(shù)量，計(jì)算其占總體的頻率，得到敏感性頻率分布(圖2)。在敏感性頻率分布中，0.024～0.030 μg/mL區(qū)間的菌株數(shù)量最多，其頻率為25.20%，敏感性頻率分布為連續(xù)單峰曲線，且80%稻瘟病菌群體對(duì)咪鮮胺的敏感性頻率近似于正態(tài)分布(P=0.081>0.05)。在藥劑作用下，根據(jù)病原菌對(duì)藥劑敏感性呈正態(tài)分布的原理[12]，可將EC50均值0.027 μg/mL作為稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺敏感基線的參考值。

103株供試稻瘟病菌菌株對(duì)三環(huán)唑的敏感性也呈連續(xù)性分布(圖1)，EC50值介于0.35～9.67 μg/mL，均值為5.24 μg/mL。其中，敏感性較弱的稻瘟病菌菌株(貴安GA12)EC50值是敏感性較強(qiáng)菌株(信陽XY6)的27.63倍。在菌株EC50值范圍內(nèi)，從0.35 μg/mL開始，設(shè)置組距為1.37 μg/mL，將其劃分為7個(gè)組，統(tǒng)計(jì)各組的菌株數(shù)量，計(jì)算其占總體的頻率，得到敏感性頻率分布(圖2)。在敏感性頻率分布中，4.460～5.830 μg/mL區(qū)間的菌株數(shù)量最多，其頻率為29.13%，敏感性頻率分布為連續(xù)單峰曲線，且稻瘟病菌群體對(duì)三環(huán)唑的敏感性頻率近似于正態(tài)分布(P=0.269>0.05)。在藥劑作用下，病原菌對(duì)藥劑的敏感性呈正態(tài)分布，因此，可將EC50均值5.24 μg/mL作為稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑敏感基線的參考值。

圖1 稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性Fig.1 EC50 values of prochloraz and tricyclazole to M.oryzae populations

圖2 稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性頻率分布

2.2 不同地區(qū)稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性

表1表明，咪鮮胺對(duì)貴州省貴安新區(qū)稻瘟病菌EC50值顯著高于對(duì)貴州省黃平縣、河南省信陽市、湖北省武穴市稻瘟病菌EC50值，除貴安新區(qū)外，咪鮮胺對(duì)其他6個(gè)地區(qū)稻瘟病菌的EC50值差異不顯著。其中，貴州省貴安新區(qū)稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺較不敏感，EC50均值為0.035 8 μg/mL，河南省信陽市稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺較為敏感，EC50均值為0.019 8 μg/mL，咪鮮胺對(duì)貴州省貴安新區(qū)稻瘟病菌的EC50值是對(duì)河南省信陽市稻瘟病菌EC50值的1.8倍。各地區(qū)稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感性差異不顯著。

表1 不同地區(qū)稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性比較Tab.1 Sensitivity of M.oryzae to prochloraz and tricyclazole from different areas

2.3 咪鮮胺和三環(huán)唑?qū)Φ疚敛【膮f(xié)同作用分析

表2表明，咪鮮胺EC50值為0.34 μg/mL，三環(huán)唑EC50值為3.58 μg/mL，咪鮮胺與三環(huán)唑有效成分比為1∶20、2∶20、3∶20、4∶20、5∶20的EC50值分別為3.31、2.35、2.23、1.10、1.56 μg/mL。其中，當(dāng)咪鮮胺與三環(huán)唑有效成分比為1∶20、2∶20、3∶20、5∶20時(shí)，共毒系數(shù)均大于80且小于120，表現(xiàn)為相加作用；當(dāng)咪鮮胺與三環(huán)唑有效成分比為4∶20時(shí)，其共毒系數(shù)為177.10，增效作用明顯，為二者的增效組合。

2.4 咪鮮胺和三環(huán)唑增效組合對(duì)水稻稻瘟病的田間防效

表3表明，咪鮮胺與三環(huán)唑(4∶20)組合對(duì)水稻稻瘟病均表現(xiàn)出良好的防治效果，且試驗(yàn)期間各處理對(duì)水稻生長無不良影響。其中，180 g/hm2咪鮮胺與三環(huán)唑(4∶20)組合對(duì)水稻稻瘟病的防治效果顯著高于45%咪鮮胺EW和75%三環(huán)唑WP。施藥后7 d，180 g/hm2咪鮮胺與三環(huán)唑(4∶20)組合對(duì)水稻稻瘟病的防治效果為68.85%，顯著高于45%咪鮮胺EW(59.27%)和75%三環(huán)唑WP(30.64%)；施藥后14 d，180 g/hm2咪鮮胺與三環(huán)唑(4∶20)組合對(duì)水稻稻瘟病的防治效果為82.29%，顯著高于45%咪鮮胺EW(80.38%)和75%三環(huán)唑WP(28.89%)；施藥后21 d，180 g/hm2咪鮮胺與三環(huán)唑(4∶20)組合對(duì)水稻稻瘟病的防治效果仍達(dá)到86.41%，顯著高于45%咪鮮胺EW(82.93%)和75%三環(huán)唑WP(27.34%)。

表2 咪鮮胺和三環(huán)唑?qū)Φ疚敛【穆?lián)合毒力Tab.2 Co-toxicity of prochloraz and tricyclazole to M.oryzae

表3 咪鮮胺·三環(huán)唑增效組合對(duì)水稻稻瘟病的防治效果Tab.3 Control effect of prochlorazole and ricyclazole combination to rice blast

3 結(jié)論與討論

本研究通過測定稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感性以及2種藥劑的協(xié)同作用，建立了稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺和三環(huán)唑的敏感基線，分別為0.027、5.24 μg/mL，篩選出咪鮮胺·三環(huán)唑的增效組合有效成為比為4∶20。而祁之秋等[12]建立遼寧省稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線為0.071 μg/mL，鄭麗娜[11]建立黑龍江省稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線為0.049 1 μg/mL，車淑靜[13]采用菌絲生長速率法建立黑龍江省稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感基線為32.24 μg/mL，與本研究建立的敏感基線均有一定差距，這可能與其采用的測定方法、地區(qū)病原菌生理小種、藥劑選擇以及用藥時(shí)間不同有關(guān)[19]。劉顯元[20]研究結(jié)果表明，黑龍江部分地區(qū)的稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑產(chǎn)生了一定的抗藥性，且有上升的趨勢；而何海永等[21]研究貴州省稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑的抗藥性，結(jié)果表明，稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑仍處于敏感或低抗水平，本研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)抗性菌株。咪鮮胺和三環(huán)唑按有效成分比4∶20組合對(duì)稻瘟病菌具有增效作用，且田間小區(qū)試驗(yàn)表明，咪鮮胺·三環(huán)唑(4∶20)180 g/hm2對(duì)水稻稻瘟病的防效達(dá)到86.41%，防治效果優(yōu)于單劑。

咪鮮胺、三環(huán)唑?qū)Ψ蛛x純化得到的103株稻瘟病菌菌株的EC50值分別為0.004 2～0.056、0.35～9.67 μg/mL，稻瘟病菌不同菌株對(duì)藥劑的敏感性差異較大，這可能與病原菌本身的差異以及群體組成的復(fù)雜多樣性有關(guān)，也可能與使用其他藥劑之間存在的微弱交互抗性有關(guān)[12]。咪鮮胺對(duì)貴州省貴安新區(qū)稻瘟病菌群體的EC50值顯著高于對(duì)貴州省黃平縣、河南省信陽市、湖北省武穴市稻瘟病菌的EC50值，而不同地區(qū)稻瘟病菌群體對(duì)三環(huán)唑的敏感性沒有顯著差異。

咪鮮胺通過抑制甾醇物質(zhì)合成，干擾病原菌細(xì)胞壁功能，導(dǎo)致病原菌死亡；三環(huán)唑能抑制附著孢的黑色素形成，孢子不能萌發(fā)，從而達(dá)到防治病害的效果。目前還未見稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生抗性的報(bào)道，趙東磊等[22]研究表明，稻瘟病菌對(duì)咪鮮胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)屬于低抗水平。張楊等[23]通過紫外線和亞硝基胍(MNNG)方法誘導(dǎo)獲得三環(huán)唑抗性菌株，對(duì)其研究表明，稻瘟病菌對(duì)三環(huán)唑?qū)儆诘涂顾幮燥L(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，咪鮮胺、三環(huán)唑仍適用于稻瘟病的防治，使用時(shí)應(yīng)考慮與其他作用機(jī)制不同的殺菌劑結(jié)合使用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長藥劑使用壽命。本研究結(jié)果顯示，咪鮮胺與三環(huán)唑4∶20混合使用，可提高對(duì)稻瘟病的防治效果，降低用藥量，延長使用壽命。