加味苓桂術(shù)甘湯對代謝綜合征大鼠脂肪細胞因子和骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

倪靖怡， 李曠怡， 張英儉， 魏華， 廖凱勁

（佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是一種以肥胖、血脂異常、高血糖和高血壓為主要特征的慢性非傳染性疾病[1]，是高血壓、糖尿病、冠心病、腦梗死等心腦血管疾病的重要危險因素，已成為全球性世界公共衛(wèi)生問題[2-4]。積極治療MS具有重要的意義。本課題組臨床應(yīng)用加味苓桂術(shù)甘湯治療MS患者，取得了良好的療效，可以改善患者體質(zhì)量、血脂、血糖和胰島素水平，但是具體機制尚未闡明。因此，本研究復(fù)制了MS 大鼠模型，給予加味苓桂術(shù)甘湯灌胃治療，觀察其對MS大鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗的改善作用，并初步探討其可能的作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級健康雄性SD大鼠50只，5 ～7周齡，體質(zhì)量（170 ± 20）g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2019-0047。普通飼料和高脂高糖高鹽飼料（按質(zhì)量分數(shù)配比：普通飼料50.5%、蔗糖15%、豬油20%、蛋黃5%、9.5%食用鹽）均購于從化市華珍動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（粵）2015-0028。

1.2 藥物加味苓桂術(shù)甘湯（茯苓15 g、桂枝12 g、白術(shù)12 g、甘草6 g、黃芪15 g、紅花10 g、桃仁10 g、茵陳蒿15 g、法半夏10 g）由佛山市中醫(yī)院中藥房代煎并濃縮至生藥含量為2 g/mL的藥液，4 ℃冰箱中保存。羅格列酮（成都恒瑞制藥有限公司，批號：20180625）。

1.3 試劑與儀器胰島素抗體放免試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；血糖、血脂試劑盒購自北京博勝經(jīng)緯科技有限公司；游離脂肪酸（FFA）、瘦素（LP）、脂聯(lián)素（ADP）、內(nèi)脂素（VF）、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPAR-γ）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT-4）ELISA 試劑盒購自上海振譽生物科技有限公司。AU5800 系列全自動生化分析儀購自貝克曼庫爾特公司；臺式高速離心機購自赫澎（上海）生物科技有限公司；UV-1100 紫外分光光度計購自北大醫(yī)療產(chǎn)業(yè)園科技有限公司；DB128無創(chuàng)血壓測量儀購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

1.4 動物分組和模型構(gòu)建[5]將50 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為空白組（10 只）和造模組（40 只）。造模組給予高脂高糖高鹽飼料連續(xù)喂養(yǎng)8 周復(fù)制MS 模型；同期，空白對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。造模結(jié)束后，若肥胖成?；A(chǔ)上符合甘油三酯（TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低，高血壓和胰島素抵抗指數(shù)（IRI）升高等4 項指標(biāo)中的任意2 項，則判斷MS 大鼠造模成功[6]。其中35只大鼠符合MS標(biāo)準(zhǔn)，5只不符合。將35只符合MS標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機分為模型組（11只）、中藥組（12只）和西藥組（12只）。

1.5 給藥方法中藥組大鼠給予加味苓桂術(shù)甘湯5.67 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組大鼠給予羅格列酮混懸液3.00 mg·kg-1·d-1灌胃，空白組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水灌胃，均連續(xù)灌胃8周。給藥期間，除空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余3組繼續(xù)高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)。

1.6 標(biāo)本采集給藥結(jié)束后，禁食不禁飲16 h，給予100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血20 mL，以3 000 r/min 離心15 min，取血清，-80 ℃保存待測；取內(nèi)臟脂肪組織（大網(wǎng)膜、腎周脂肪組織）和腓腸肌組織，-80 ℃保存待測。

1.7 觀察指標(biāo)與方法電子天平測量體質(zhì)量。測量 體 長 。 計 算 Lee’s 指 數(shù) ， Lee’s 指 數(shù) =應(yīng)用無創(chuàng)血壓測量儀測量大鼠尾動脈血壓。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。放射免疫法測定血清空腹胰島素（FINS）。計算IRI，IRI = FBG ×FINS/22.5。稱取脂肪組織加生理鹽水，4 ℃研磨制成勻漿，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA 法檢測脂肪組織FFA、LP、ADP、VF、PPAR-γ 含量；稱取腓腸肌加生理鹽水研磨，以3 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用ELISA 法檢測腓腸肌GLUT-4含量。

1.8 統(tǒng)計方法采用SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的比較表1 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)、SBP、DBP 均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)、SBP、DBP均明顯降低（P＜0.05），且2個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平的比較表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠TC、TG、LDL-C水平均明顯降低（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的比較Table 1 Comparison of the levels of body mass，Lee’s index，SBP，DBP in various groups （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的比較Table 1 Comparison of the levels of body mass，Lee’s index，SBP，DBP in various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥組西藥組N/只10 11 12 12體質(zhì)量（m/g）386.56±24.56 498.85±64.24①456.52±38.29②437.61±48.53②Lee’s指數(shù)（g·cm-1）312.42±19.57 386.92±34.12①354.58±28.43②348.24±24.52②SBP（p/mmHg）109.24±9.54 149.24±24.36①132.46±16.71②128.14±15.74②DBP（p/mmHg）76.85±9.43 98.76±7.64①87.63±6.82②85.37±10.25②

表2 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比較Table 2 Comparison of the levels of TC，TG，HDL-C，LDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

表2 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比較Table 2 Comparison of the levels of TC，TG，HDL-C，LDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥組西藥組N/只10 11 12 12 TC 2.18±0.37 3.76±0.64①2.75±0.54②2.64±0.31②TG 1.26±0.43 2.34±0.52①1.72±0.36②1.58±0.29②HDL-C 0.95±0.13 0.56±0.12①0.73±0.09②0.68±0.08②LDL-C 1.26±0.28 2.03±0.24①1.86±0.35②1.67±0.31②

2.3 各組大鼠FBG、FINS、IRI水平的比較表3結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠FBG、FINS、IRI水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠FBG、FINS、IRI 水平均明顯降低（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.4 各組大鼠內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、ADP、VF、PPAR-γ含量的比較表4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、VF含量明顯升高（P＜0.05），ADP、PPAR-γ 含量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、VF 含量均明顯降低（P＜0.05），ADP、PPAR-γ 含量均明顯升高（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠FBG、FINS、IRI水平的比較Table 3 Comparison of the levels of BG，F(xiàn)INS，IRI in various groups （±s）

表3 各組大鼠FBG、FINS、IRI水平的比較Table 3 Comparison of the levels of BG，F(xiàn)INS，IRI in various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥組西藥組N/只10 11 12 12 FBG[c/（mmol·L-1）]5.16±0.24 8.24±1.32①6.45±0.67②6.21±0.52②FINS[J/（mIU·L-1）]13.21±2.18 24.13±3.71①17.21±3.12②16.32±2.61②IRI 3.03±0.21 8.84±0.65①4.93±0.37②4.51±0.26②

2.5 各組大鼠腓腸肌組織GLUT-4含量的比較表5結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠腓腸肌組織GLUT-4 含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠腓腸肌組織GLUT-4含量明顯升高（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表4 各組大鼠內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、ADP、VF、PPAR-γ含量的比較Table 4 Comparison of the contents of FFA，LP，ADP，VF，PPAR-γ in visceral adipose tissue of various groups （±s）

表4 各組大鼠內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、ADP、VF、PPAR-γ含量的比較Table 4 Comparison of the contents of FFA，LP，ADP，VF，PPAR-γ in visceral adipose tissue of various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥組西藥組N/只10 11 12 12 FFA[c/（μmol·L-1）]68.34±9.25 106.35±12.48①89.68±8.42②96.58±10.34②LP[ρ/（ng·mL-1）]13.65±1.27 27.69±3.58①19.67±2.14②17.56±2.25②ADP[ρ/（ng·mL-1）]5.13±0.24 2.68±0.32①3.65±0.29②3.24±0.16②VF[c/（mmol·L-1）]12.36±1.95 26.57±4.25①17.39±2.65②19.34±3.18②PPAR-γ[ρ/（ng·mL-1）]6.57±0.28 3.16±0.17①4.48±0.23②4.62±0.24②

表5 各組大鼠腓腸肌組織GLUT-4含量的比較Table 5 Comparison of the content of GLUT-4 in gastrocnemius tissue of various groups （±s）

表5 各組大鼠腓腸肌組織GLUT-4含量的比較Table 5 Comparison of the content of GLUT-4 in gastrocnemius tissue of various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥組西藥組N/只10 11 12 12 GLUT-4[ρ/（ng·mL-1）]7.98±0.34 4.65±0.46①5.37±0.32②5.62±0.29②

3 討論

代謝綜合征（MS）屬于中醫(yī)學(xué)“痰濕”“消渴”等范疇。MS 的主要病機是脾虛不運，痰瘀阻滯[8-9]。苓桂術(shù)甘湯出自《傷寒論》，方中：茯苓淡滲利濕，健脾益氣；桂枝溫陽化氣，溫通經(jīng)脈；白術(shù)益氣健脾，燥濕利水；甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥。本方在苓桂術(shù)甘湯基礎(chǔ)上加黃芪以補中益氣、健脾利水，加紅花、桃仁活血化瘀，加茵陳蒿清熱利濕、半夏燥濕化痰以加強化痰利濕之功效。諸藥合用，共奏健脾益氣、化痰祛濕、活血化瘀之功效。本研究采用高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)方法建立MS大鼠模型，觀察加味苓桂術(shù)甘湯對其治療效果。結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、SBP、DBP、FBG、FINS、TC、TG、LDL-C、IRI、Lee’s指數(shù)水平均明顯升高，HDL-C、ADP水平明顯降低（均P＜0.05）。表明以高脂高糖高鹽方法喂養(yǎng)成功建立了MS模型，存在明顯的胰島素抵抗。給藥后，與模型組比較，中藥組大鼠的體質(zhì)量、SBP、DBP、FBG、FINS、TC、TG、LDL-C、IRI、Lee’s 指數(shù)水平均明顯降低，HDL-C、ADP水平明顯升高（均P＜0.05）。表明加味苓桂術(shù)甘湯可以改善MS大鼠的糖脂代謝和胰島素抵抗，且與羅格列酮療效相當(dāng)。

目前，多數(shù)學(xué)者認為胰島素抵抗是MS重要的病理基礎(chǔ)和中心環(huán)節(jié)[10]。胰島素抵抗使糖原攝取和利用受損，肝糖原合成和糖異生障礙，繼發(fā)代償性的高胰島素血癥，由此產(chǎn)生一系列病理生理變化，導(dǎo)致MS 的發(fā)生[11]。研究[12]表明，脂肪組織是人體重要的內(nèi)分泌器官，其分泌的脂肪細胞因子可以參與能量代謝，調(diào)節(jié)胰島素生物學(xué)效應(yīng)，與胰島素抵抗具有密切的聯(lián)系。胰島素可刺激脂肪組織分泌LP，LP濃度升高可以減少攝食和增加能量消耗，并且可以與胰島β 細胞上的LP 受體結(jié)合，抑制胰島素分泌，改善胰島素抵抗[13]；而MS患者由于脂肪堆積，LP 分泌異常，形成LP 抵抗，導(dǎo)致抑制胰島素分泌能力受損，進而導(dǎo)致胰島素抵抗。脂肪組織分泌的FAA 可以抑制肝臟對葡萄糖攝取的利用，抑制糖氧化，從而刺激胰島β細胞分泌胰島素，導(dǎo)致胰島素抵抗[14]。VF 是脂肪細胞分泌的一種具有類胰島素作用的脂肪因子，是導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵因子[15]。ADP是脂肪細胞分泌的細胞因子，具有增加FFA 氧化、減少脂質(zhì)儲存和增加胰島素敏感性等作用[16]。PPAR-γ 是調(diào)控脂肪因子和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，在調(diào)節(jié)糖脂代謝、脂肪細胞分化、增強胰島素敏感性和抗炎進而改進胰島素抵抗方面起著重要作用；而MS患者中PPAR-γ表達明顯降低，從而導(dǎo)致脂肪因子分泌異常和胰島素抵抗[17]。GLUT-4 是由脂肪和骨骼肌分泌的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，胰島素通過與細胞表面的胰島素受體結(jié)合，刺激GLUT-4從內(nèi)部轉(zhuǎn)移至細胞膜，加速對葡萄糖的攝取和利用[18]；全身50%～80%的葡萄糖由GLUT-4承擔(dān)轉(zhuǎn)運，而骨骼肌GLUT-4 承擔(dān)了其中70% ～80%的葡萄糖轉(zhuǎn)運，是全身葡萄糖轉(zhuǎn)運的最重要場所，而脂肪組織GLUT-4僅占較少部分。MS患者若GLUT-4轉(zhuǎn)位功能障礙，刺激胰島素分泌，發(fā)生高胰島素血癥和胰島素抵抗，可加重MS。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠脂肪組織FFA、LP、VF水平明顯升高，骨骼肌組織GLUT-4、脂肪組織PPAR-γ含量明顯降低（均P＜ 0.05）。表明MS大鼠胰島素抵抗，可能與FFA、LP、VF、ADP 等分泌增加以及PPAR-γ、GLUT-4 水平明顯降低相關(guān)?！端貑枴ぬ庩柮髡摗费裕骸八闹苑A氣于胃，而不得至經(jīng)，必因于脾，乃得稟也。”MS 患者由于脾胃虧虛，生化乏源，四肢肌肉失養(yǎng)，故骨骼肌GLUT-4 基因和蛋白表達減少。脾虛失運，且MS患者嗜食肥甘厚膩，痰濁內(nèi)生，聚集于內(nèi)臟脂肪組織，F(xiàn)FA、LP、VF、ADP、PPAR-γ失調(diào)。給藥后，與模型組比較，中藥組大鼠FFA、LP、VF 水平明顯降低，PPAR-γ、GLUT-4 水平明顯升高（均P＜0.05）。表明加味苓桂術(shù)甘湯可以改善MS 大鼠的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，與抑制脂肪組織FFA、LP、VF 的分泌，上調(diào)GLUT-4、PPAR-γ 水平有關(guān)，且與羅格列酮療效相當(dāng)。

綜上所述，加味苓桂術(shù)甘湯可有效改善MS大鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，其機制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)臟脂肪組織FFA、LP、ADP、VF、PPAR-γ等脂肪細胞因子和骨骼肌GLUT-4表達有關(guān)。