解表清里復(fù)方干預(yù)急性支氣管炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制

張軍城， 張濤， 李耀輝， 劉改霞， 唐秀林， 康艷， 劉伊莎

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安 710000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046）

急性支氣管炎是一種常見的、具有自限性的呼吸道感染性疾病[1]。屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”的范疇，以外感病邪誘發(fā)者居多，以寒邪最為常見[2-3]，外感寒邪入里，或從寒化、或從熱化。我院省名中醫(yī)曹利平主任醫(yī)師針對急性支氣管炎患者證型的動態(tài)演變規(guī)律認(rèn)為表寒里熱證型最為常見，并擬定解表清里治則以及解表清里復(fù)方（金銀花、連翹、黃芩、浙貝母、桑白皮、款冬花、紫菀、陳皮、法半夏、茯苓、蘇葉、桔梗、炒麥芽）[4-5]。前期臨床研究納入100 例細(xì)菌性急性支氣管炎患者，治療組單用解表清里復(fù)方，對照組采用托西酸舒他西林聯(lián)合咳必清，結(jié)果表明解表清里復(fù)方治療急性支氣管炎療效較好，在一定程度上可以減少抗生素的使用[4]。為進(jìn)一步明確解表清里復(fù)方的作用機(jī)制以推廣臨床應(yīng)用，故進(jìn)行本項研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 解表清里復(fù)方有效成分檢索本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫，即TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別檢索解表清里復(fù)方中單味中藥，按照口服生物利用度＞30%，類藥性＞0.18進(jìn)行有效成分篩選提取藥物的有效成分及藥物有效成分相對應(yīng)的靶基因。

1.2 有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將TCMSP 數(shù)據(jù)庫所獲得的靶基因輸入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/），對藥物有效成分的基因名進(jìn)行轉(zhuǎn)換，并將其與藥物有效成分相映射構(gòu)建文本文件，然后將上述得到的文件分別導(dǎo)入Cytoscape v3.6.0 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。并點擊“network analysis”對構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，分析相關(guān)參數(shù)。

1.3 急性支氣管炎疾病基因獲取以“acute bronchitis”作為檢索詞同時檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）。檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫時，在打開網(wǎng)頁之后點擊“Gene Map”，在搜索框中輸入檢索詞，即可得到該數(shù)據(jù)庫中的疾病基因；檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫時，在打開網(wǎng)頁之后在關(guān)鍵詞檢索框中輸入檢索詞，即可得到該數(shù)據(jù)庫中的疾病基因；檢索DisGeNET 數(shù)據(jù)庫時，在打開網(wǎng)頁后點擊“search”，選擇“diseases”并在下方檢索框中輸入檢索詞，即可得到該數(shù)據(jù)庫中的疾病基因。最后將上述數(shù)據(jù)庫中所得的基因進(jìn)行匯總，刪除重復(fù)基因。

1.4 關(guān)鍵靶點預(yù)測打開OmicShare平臺（http：//www.omicshare.com），選擇云平臺后選擇維恩圖，再將藥物基因與疾病基因的文件導(dǎo)入，選擇提交后即可得到疾病基因與藥物基因的交集，也就是解表清里復(fù)方治療急性支氣管炎的核心靶點。

1.5 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）是最常用的蛋白數(shù)據(jù)庫，在STRING 數(shù)據(jù)庫中選擇Multiple proteins，然后將OmicShare 得到的交集基因輸入搜索框中，Organism 選擇為“Homo sapiens”開始搜索，再次點擊“continue”，在設(shè)置中將分?jǐn)?shù)選擇0.7，并隱藏散在的節(jié)點即可得到蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因本體論（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是較為全面的生物功能注釋信息平臺。將解表清里復(fù)方靶基因與疾病基因的交集基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)類型選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”， 表 格 類 型 選 擇“gene list”，物種類型選擇“Homo sapiens”，背景選 擇 “Homo sapiens”， 再 選 擇 “Functional Annotation Tool”即可選擇進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析。進(jìn)行GO 富集生物過程及KEGG富集信號通路的篩選限定條件為P＜0.05、FDR＜0.05 以及所研究疾病的相關(guān)性，若所得結(jié)果仍較多，則根據(jù)所富集基因數(shù)目選取前20 位，最后采用EXCEL進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果

2.1 解表清里復(fù)方化合物成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到：金銀花有效成分23種，相關(guān)靶點1 647個；連翹有效成分23種，相關(guān)靶點1 425個；黃芩有效成分36種，相關(guān)靶點1 203個；浙貝母有效成分7 種，相關(guān)靶點110 個；桑白皮有效成分32 種，相關(guān)靶點1 375個；款冬花有效成分22種，相關(guān)靶點1 088個；紫菀有效成分19種，相關(guān)靶點857個；陳皮有效成分5種，相關(guān)靶點479個；半夏有效成分13種，相關(guān)靶點1 302個；茯苓有效成分15種，相關(guān)靶點121 個；紫蘇有效成分14 種，相關(guān)靶點2 481個；桔梗有效成分7種，相關(guān)靶點260個；麥芽有效成分18 種，相關(guān)靶點646 個。刪除重復(fù)有效成分和重復(fù)靶點后共獲得有效成分131種，靶點134個。

2.2 急性支氣管炎疾病基因檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫共得到疾病基因44 個，刪除重復(fù)基因后得到疾病基因30個；檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫共得到疾病基因848 個；檢索DisGeNET 數(shù)據(jù)庫得到1 個疾病基因。將所獲得全部基因匯總，去掉重復(fù)基因后得到876個急性支氣管炎疾病基因。

2.3 藥物有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)將含有有效成分與靶基因的文件導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建藥物有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中包含265個節(jié)點，1 525條邊，紅色表示藥物的靶基因，綠色表示藥物的有效成分，灰色線條作為邊即表示有效成分與靶基因之間的關(guān)系。詳見圖1。對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，其中?jié)點度值（degree）越大的有效成分或靶基因提示它可能越重要，結(jié)果位于度值前5位的有效成分分 別 是 quercetin、 kaempferol、 luteolin、 betasitosterol、wogonin，度值前5 位的靶基因分別是NCOA2、PTGS1、AR、PRSS1、PPARG。見表1。

2.4 關(guān)鍵靶點預(yù)測結(jié)果將疾病基因與藥物靶基因匯總，整理成為文本文件。然后，采用OmicShare 平臺中的維恩圖繪制圖片，共得到HSPB1、 CD163、 PLAU、 CYCS、 CACNA2D1、CCNB1、 IRF1、 ALOX5、 GSTM1、 BIRC5、MDM2、 EGFR、 IKBKB、 NQO1、 ERBB3、ERBB2、 CHEK1、 MUC1、 BCL2、 MAPK8、ICAM1、 CAV1、 CYP1A1、 CASP8、 PPARG、CHEK2、 CRP、 HIF1A、 NOS3、 GSTP1、 RB1、SELE、 AHR、 NR3C1、 RAF1、 CASP9、 PCNA、CTNNB1、 ABCC1、 CHRM3、 CCND1、 NFKBIA、IGFBP3、ALB、PTGS1、VEGFA、MYC、TIMP1、ESR2、 MCL1、 PRKCA、 RASSF1、 CYP3A4、IL6、TP63、CYP1B1、APP、CASP3、PARP1等59個交集基因。見圖2。

2.5 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為了更直觀地了解解表清里復(fù)方干預(yù)急性支氣管炎的作用機(jī)制，將上述所得疾病與藥物的交集靶點輸入STRING V11.0 平臺構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)中共包含59個節(jié)點，227條邊，將網(wǎng)絡(luò)信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8、IL6、CCND1、MYC 等基因的節(jié)點度值（大于18）遠(yuǎn)高于其他靶點，表明上述靶點可能在疾病的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，屬于核心靶點。

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，對上述交集靶點所獲得的59個基因進(jìn)行分析，共得到16個富集的生物過程聚類，分為90 個條目，其中具有顯著意義的8 個條目為：抗生素的反應(yīng)、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA 模板化、異種代謝過程、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、傷口愈合、基底外側(cè)質(zhì)膜。詳見圖4、表2。KEGG通路富集分析共獲得14 個富集的通路聚類，分為147 條通路，其中有顯著意義的通路26 條。刪除10條重復(fù)的通路，再排除癌癥相關(guān)的通路7條，最終剩余9條通路，分別為乙肝、弓形蟲病、病毒性心肌炎、細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、慢性粒細(xì)胞性白血病、焦點粘附、甲狀腺激素信號通路、EB 病毒感染。詳見圖5、表3。為了更加清晰地展示解表清里復(fù)方治療急性支氣管炎的作用機(jī)制，對上述所得藥物有效成分、藥物靶點以及通路進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中紅色代表通路，綠色代表化合物，藍(lán)色代表藥物靶點。詳見圖6。

圖1 解表清里復(fù)方有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)Figure 1 The active ingredient-target gene network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

表1 解表清里復(fù)方有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)Table 1 Topological parameters of active ingredienttarget network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

圖2 解表清里復(fù)方干預(yù)急性支氣管炎的關(guān)鍵靶點預(yù)測圖Figure 2 Prediction chart for key targets of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe intervention for acute bronchitis

圖3 解表清里復(fù)方干預(yù)急性支氣管炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Proteins interaction network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe intervention for acute bronchitis

3 討論

急性支氣管炎在老年人、免疫力低下人群以及天氣變化和季節(jié)交替時的發(fā)病率明顯升高[6-7]。據(jù)報道，急性支氣管炎約90%是呼吸道病毒所導(dǎo)致的，因此指南及專家共識推薦使用化痰藥、鎮(zhèn)咳藥、抗組胺藥以及對癥治療，不推薦常規(guī)使用抗生素[8-11]，除非有明確的細(xì)菌感染證據(jù)，如痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)等。急性支氣管炎屬排除性診斷，沒有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，也沒有特異性的治療藥物[12]。中醫(yī)藥長期以來被用于治療急性咳嗽性疾病以及其他呼吸道感染性疾病[13]，具有辨證論治的優(yōu)勢，可多成分-多靶點-多途徑發(fā)揮抗菌和抗病毒的作用。探討有效治療該病的中藥方劑療效及機(jī)制具有重要的意義。

圖4 GO生物功能富集分析Figure 4 GO biological function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis

本研究采用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫資料分析解表清里復(fù)方治療急性支氣管炎的作用機(jī)制。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集到有效成分131種，靶點134個，收集到的有效成分及靶點中重復(fù)的成分較多，眾多的有效成分和靶點也表明解表清里復(fù)方中聯(lián)合多種藥物對于疾病的治療可能存在疊加效應(yīng)?；蚬δ荜P(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn) VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8、IL6、CCND1、MYC 等基因為核心靶點，可以認(rèn)為解表清里復(fù)方主要作用于上述核心基因而發(fā)揮治療效應(yīng)。其中，VEGFA 會受炎性因子的影響，且參與調(diào)節(jié)固有免疫[14]；CASP3、MAPK8、MYC 主要參與細(xì)胞凋亡，對機(jī)體受損傷的細(xì)胞予以清除從而維持自身穩(wěn)定[15-17]；EGFR 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生，并與蛋白水解酶的分泌從而發(fā)揮保護(hù)黏膜和修復(fù)損傷的作用[18]；IL-6是最常見的炎癥因子，對于鑒別細(xì)菌感染與病毒感染具有一定的意義[19]；CCND1可以通過阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用[20]。

表2 GO富集篩選后的條目Table 2 GO enriched and filtered entries

表3 KEGG通路富集篩選后的條目Table 3 KEGG pathway enriched and filtered entries

圖6 解表清里復(fù)方有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Figure 6 The active ingredient-target-pathway network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

解表清里復(fù)方是基于表寒里熱證而設(shè)立的，以清熱為主兼以解表?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，方中黃芩[21]、桑白皮[22]及浙貝母[23]等具有清熱作用的中藥可以降低炎癥因子的表達(dá)水平，從而發(fā)揮對疾病的治療作用。GO富集分析提示解表清里復(fù)方可能通過抗生素的反應(yīng)、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA 模板化、異種代謝過程、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、傷口愈合、基底外側(cè)質(zhì)膜等生物過程等發(fā)揮作用。急性支氣管炎導(dǎo)致支氣管黏膜充血水腫從而刺激氣道黏膜、腺體分泌增多，繼而出現(xiàn)咳嗽、咳痰等癥狀，解表清里復(fù)方通過宣散表邪而止咳，清瀉里熱而化痰，臨床研究認(rèn)為該復(fù)方的臨床療效與抗生素相比無顯著性差異[10]，推測上述生物過程中的抗生素反應(yīng)及傷口愈合與治療作用的發(fā)揮關(guān)系可能更加密切[24-25]。KEGG 通路富集分析提示解表清里復(fù)方可能通過乙肝、弓形蟲病、病毒性心肌炎、細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、慢性粒細(xì)胞性白血病、焦點粘附、甲狀腺激素信號通路、EB 病毒感染等通路發(fā)揮作用。目前研究認(rèn)為導(dǎo)致急性支氣管炎的病原體很多，包括病毒、細(xì)菌、非典型病原體等，但以病毒感染最為常見，推測上述通路中細(xì)胞凋亡、TNF 信號通路以及EB 病毒感染與急性支氣管炎的病因和發(fā)病機(jī)制的關(guān)系可能更加密切。

綜上所述，解表清里復(fù)方對于急性支氣管炎的治療可能是通過多種藥物成分作用于多個疾病基因，通過多種機(jī)制發(fā)揮治療效應(yīng)。但本研究僅僅只是基于數(shù)據(jù)庫提取單味藥物的有效成分及靶點，復(fù)方的作用也僅僅只是單味藥物的成分及靶點機(jī)械相加，而實際上中藥湯劑在煎煮過程中可能產(chǎn)生了更為有效的化合物，對此，有待在進(jìn)一步的實驗中加以證實。