炎癥因子在肩袖損傷大鼠中的表達(dá)及其臨床意義

郭銳， 董云， 楊勇， 關(guān)浩， 王福川*， 張芳， 許嘯， 鄭小飛， 王華軍*

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054001；2.河北省邢臺(tái)市第五醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000；3.解放軍第四二一醫(yī)院，廣東 廣州 510318；4.暨南大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院/附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632)

肩袖損傷已經(jīng)成為最常見(jiàn)的肩部疾病.在英國(guó)，每100人中就有1.6人至少做過(guò)1次鏡下肩袖修復(fù)術(shù).過(guò)去10年間，關(guān)節(jié)鏡下的肩袖修復(fù)手術(shù)增長(zhǎng)了600%[1-3].據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)80歲以上老年人群中，患有肩袖損傷約占51%，其中每年超過(guò)25萬(wàn)患者需要肩袖修復(fù)手術(shù)治療，醫(yī)療花費(fèi)甚至超過(guò)70億美元[4-5].因此，深入了解肩袖損傷診治及康復(fù)的病理生理學(xué)過(guò)程，促進(jìn)損傷肩袖的愈合成為亟待解決的問(wèn)題.近年來(lái)，關(guān)節(jié)液生物因子表達(dá)變化的研究逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視.損傷組織代謝釋放入關(guān)節(jié)液中的生物因子，不僅可以反映關(guān)節(jié)組織損傷病情進(jìn)展，往往還發(fā)揮其生物學(xué)作用，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-7].目前，在膝關(guān)節(jié)液生物因子與骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)的相互作用中開(kāi)展了深入的研究[6-8].但關(guān)于肩關(guān)節(jié)液生物因子的研究相對(duì)較少，尤其是肩袖損傷后關(guān)節(jié)液中生物因子的表達(dá)變化，及其與肩袖損傷的病理生理進(jìn)展和患者癥狀之間的關(guān)系還未明確.因此，本研究檢測(cè)了大鼠肩袖損傷關(guān)節(jié)液中重要炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)，并對(duì)肩袖損傷大鼠疼痛與炎癥因子之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，以期為明確關(guān)節(jié)液中生物因子在肩袖損傷和愈合過(guò)程中作用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取清潔級(jí)雄性spraguedaw(SD)大鼠60只，鼠齡3～4個(gè)月，平均體質(zhì)量為(278.35±21.42)g.根據(jù)隨機(jī)數(shù)據(jù)表法將其隨機(jī)分為手術(shù)組及假手術(shù)組，每組30只.所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只，動(dòng)物房安靜，無(wú)強(qiáng)光直射，溫度維持于20～25℃，濕度60%～70%，大鼠自由飲食及飲水.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置參照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[9].

1.1.2 試劑及設(shè)備

戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)、全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sorvall Biofuge Stratos，美國(guó) Thermo Scientific公司)；酶標(biāo)儀(奧地利 CliniBio128 型)；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒(美國(guó) R&D 公司).

1.2 方法

1.2.1 大鼠肩袖損傷模型制備

參照經(jīng)典肩袖損傷模型方法造模[6].大鼠禁食、水24 h稱質(zhì)量后腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，按40 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉[7]，麻醉成功后俯臥固定.以大鼠右側(cè)肩胛區(qū)剪毛、消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)巾.手術(shù)組建立肩袖損傷模型，于大鼠右肩胛岡肩峰端作一縱行切口，長(zhǎng)約1.5 cm，分離淺筋膜至暴露肩胛區(qū)及上臂肌肉，找到斜方肌附著部，分離并向前上方翻開(kāi)即可見(jiàn)岡上肌位于斜方肌覆蓋之下.仔細(xì)分離整條岡上肌至肱骨大結(jié)節(jié)止點(diǎn)，顯露大鼠岡上肌腱，將岡上肌腱橫行切斷約1/2(切忌全部切斷，防止肌腱回縮)，壓迫止血，逐層縫合切口.假手術(shù)組(對(duì)照組)于右肩胛部做相同皮膚切口，暴露岡上肌腱后不做剪切，縫合切口.術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水及活動(dòng).術(shù)后予以肌注青霉素(40萬(wàn)單位/d)，持續(xù)1周.在大鼠蘇醒后密切觀察其步態(tài)、進(jìn)食和傷口愈合情況，評(píng)價(jià)造模效果.

1.2.2 大鼠關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分(縮腿嘶鳴評(píng)分)

參照文獻(xiàn)檢測(cè)疼痛方法[8,10]，于術(shù)后第2、4、8周，將SD大鼠頭部套上軟套，放入特制的塑料筒內(nèi)，兩前腿露出筒外，穩(wěn)定3～5 min后進(jìn)行測(cè)定.向腳掌側(cè)緩慢屈曲(跖屈)大鼠的右側(cè)肩關(guān)節(jié)，觀察其嘶叫或短促而明顯的縮腿反應(yīng)，無(wú)反應(yīng)評(píng)分為0，若出現(xiàn)一種反應(yīng)評(píng)分為1，兩者均出現(xiàn)評(píng)分為 2，兩種指標(biāo)的總評(píng)分為0～10.由同一名具有豐富相關(guān)測(cè)試經(jīng)驗(yàn)的人員，每隔5 s進(jìn)行一次，進(jìn)行5次測(cè)試.將肩關(guān)節(jié)向足背側(cè)彎曲，可測(cè)得背屈關(guān)節(jié)疼痛實(shí)驗(yàn)評(píng)分，評(píng)分方法與跖屈關(guān)節(jié)評(píng)分方法相同.用縮腿、嘶鳴兩者的總評(píng)分來(lái)反映關(guān)節(jié)疼痛的程度更為全面，且可彌補(bǔ)兩種評(píng)分各自的缺點(diǎn)，可有效客觀衡量大鼠關(guān)節(jié)疼痛.

1.2.3 測(cè)定IL-1β、IL-6 和 TNF-α含量

于術(shù)后第2、4、8周在2組中各取10只大鼠，用過(guò)量的戊巴比妥腹腔注射進(jìn)行處死，在原手術(shù)區(qū)備皮后常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌巾，按原切口進(jìn)入，暴露肩關(guān)節(jié)，切開(kāi)肩關(guān)節(jié)囊及滑囊，抽取關(guān)節(jié)液，離心去除組織細(xì)胞和碎屑，取上清液.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)方法檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按 ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次試驗(yàn)，取其結(jié)果平均值.完成后使用酶標(biāo)儀于 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度值(optical density，OD)進(jìn)行檢測(cè).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的D(450nm)值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再依據(jù)樣品D(450nm)值計(jì)算出相應(yīng)IL-1β、IL-6和TNF-α的含量.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0軟件行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的方式表示.采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兩組大鼠造模當(dāng)天即自主進(jìn)食，但均有不同程度的攝食減少，跛行步態(tài).對(duì)照組大約2～5 d后逐漸恢復(fù)正常；手術(shù)組食量2～5 d恢復(fù)，跛行步態(tài)持續(xù)存在；所有大鼠術(shù)口均未發(fā)生紅腫感染，實(shí)驗(yàn)中途未見(jiàn)死亡脫落.

2.2 疼痛評(píng)分

手術(shù)組在3個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)的疼痛評(píng)分均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1.

表1 兩組造模后疼痛評(píng)分的對(duì)比

2.3 IL-1β質(zhì)量濃度對(duì)比

手術(shù)組在3個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)的IL-1β含量均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2.

表2 兩組造模后IL-1β質(zhì)量濃度的對(duì)比

2.4 IL-6質(zhì)量濃度對(duì)比

手術(shù)組在3個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)的IL-6含量均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表3.

表3 兩組造模后IL-6質(zhì)量濃度的對(duì)比

2.5 TNF-α質(zhì)量濃度對(duì)比

手術(shù)組在3個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)的TNF-α含量均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4.

表4 兩組造模后TNF-α質(zhì)量濃度的對(duì)比

2.6 疼痛評(píng)分與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

手術(shù)組疼痛評(píng)分與IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度分呈正相關(guān)(r=0.329，P=0.028；r=0.861，P=0.001；r=0.907，P=0.001)，隨著炎癥指標(biāo)含量的下降，關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分也逐漸降低，見(jiàn)表5.

表5 疼痛評(píng)分與3個(gè)炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

(1)手術(shù)組中SD大鼠肩關(guān)節(jié)液中IL-1β質(zhì)量濃度與疼痛評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.329，P<0.05)(圖1)，隨著IL-1β表達(dá)水平的升高，大鼠關(guān)節(jié)疼痛加重.

圖1 IL-1β質(zhì)量濃度與疼痛評(píng)分相關(guān)性

(2)手術(shù)組中SD大鼠肩關(guān)節(jié)液中IL-6水平與疼痛評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.813，P<0.05)(圖2)，IL-6表達(dá)水平的升高，大鼠關(guān)節(jié)疼痛加重.

圖2 IL-6質(zhì)量濃度與疼痛評(píng)分相關(guān)性

(3)手術(shù)組中SD大鼠肩關(guān)節(jié)液中TNF-α水平與疼痛評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.907，P<0.05)(圖3)，TNF-α表達(dá)水平的升高，大鼠關(guān)節(jié)疼痛加重.

圖3 TNF-α質(zhì)量濃度與疼痛評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

肩袖在肩關(guān)節(jié)動(dòng)態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，在運(yùn)動(dòng)乃至生活中很容易受到損傷.肩袖損傷是導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)障礙的最主要原因之一，約占肩關(guān)節(jié)疾病的50%[11].隨著年齡的增加，發(fā)病率逐步增高，60歲以上人群約25.6%患有肩袖損傷，70歲以上人群更是高達(dá)45.8%[12].目前我國(guó)60歲以上人口達(dá)到2.22億，占人口總數(shù)的16.1%，因此，我國(guó)肩袖損傷患者人群十分龐大，深入了解肩袖損傷診治及康復(fù)的病理生理學(xué)過(guò)程，促進(jìn)損傷肩袖的愈合成為亟待解決的問(wèn)題.

肩袖損傷導(dǎo)致疼痛的確切機(jī)制目前尚不清楚，通常認(rèn)為肩袖損傷疼痛是由于局部損傷肌腱牽拉而引起.近年來(lái)，關(guān)節(jié)液中生物因子表達(dá)變化及其與關(guān)節(jié)疾病的關(guān)系越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視[13-15].當(dāng)關(guān)節(jié)出現(xiàn)病變時(shí)，損傷組織代謝釋放入關(guān)節(jié)液中的生物因子，不僅可以反映關(guān)節(jié)組織損傷病情進(jìn)展，往往還發(fā)揮其生物學(xué)作用，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展，能更直接更敏感的反映關(guān)節(jié)的生理病理情況[16-18].目前，對(duì)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液已經(jīng)開(kāi)展了深入的研究.有研究發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-2、IL-6和 TNF-α的含量與膝關(guān)節(jié)影像學(xué)分級(jí)以及臨床癥狀有明顯相關(guān)性，較影像學(xué)檢查更具敏感性，可輔助 OA 的早期診斷[13].在膝關(guān)節(jié)感染的早期診斷中關(guān)節(jié)液檢測(cè)也起到了重要作用，例如關(guān)節(jié)液中α-防御素較血清學(xué)檢測(cè)中的C-反應(yīng)蛋白和血沉具有更好的敏感性及特異度[14].但是目前關(guān)于肩關(guān)節(jié)液的研究相對(duì)較少，鑒于肩袖損傷是肩關(guān)節(jié)最常見(jiàn)的疾病，本研究通過(guò)大鼠肩袖損傷模型，研究肩關(guān)節(jié)液中生物因子的表達(dá)變化，繼而闡明其與肩袖損傷的病理生理進(jìn)展和疼痛等癥狀之間的關(guān)系.

在以往的研究中，Siu等[18]收集了68名肩袖損傷患者關(guān)節(jié)液，檢測(cè)并分析了IL-1β 和 IL-6與患者肩關(guān)節(jié)功能評(píng)分，關(guān)節(jié)活動(dòng)度以及疼痛評(píng)分之間的關(guān)系，結(jié)果顯示肩關(guān)節(jié)液中IL-1β 和 IL-6水平與患者的癥狀呈負(fù)相關(guān).但也有研究發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)論.Abrams等[19]對(duì)比研究了19名肩袖損傷患者和11名肩袖完整志愿者的關(guān)節(jié)滑膜和滑液炎癥因子的表達(dá)，證明肩袖損傷患者炎癥因子表達(dá)確實(shí)升高，但與患者的癥狀無(wú)相關(guān)性.而Chaudhury等[20]的研究甚至得到相反的結(jié)論.他們對(duì)比了16名肩袖損傷患者和12名肩袖完整志愿者的肩袖基因表達(dá)變化，分析發(fā)現(xiàn)IL-6等多種炎癥因子基因表達(dá)顯著下降.由此可見(jiàn)目前對(duì)于肩袖損傷患者關(guān)節(jié)液炎癥因子表達(dá)變化還存在爭(zhēng)議.本研究同時(shí)檢測(cè)了肩袖損傷愈合過(guò)程中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行縱向的對(duì)比分析，結(jié)果證明肩袖損傷后炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高，隨著損傷愈合含量逐漸降低.而大鼠患肢的疼痛也隨著炎性因子的降低而緩解.進(jìn)一步的相關(guān)性分析證明IL-1β、IL-6和TNF-α與大鼠疼痛呈正相關(guān)，與Siu等的研究結(jié)果一致.我們利用大鼠構(gòu)建肩袖損傷模型，具有高度的統(tǒng)一性和可比性進(jìn)行研究.而上述研究中納入的患者數(shù)量有限，而且基本資料不具有可比性，患者身高、性別和年齡等干擾因素較多，影響結(jié)果可比性.其次，設(shè)立了多個(gè)標(biāo)本采集的時(shí)間點(diǎn)，可以進(jìn)行縱向的對(duì)比分析.而以往的研究多為橫斷面研究，缺乏隨訪資料的收集分析，因此結(jié)論具有一定的局限性.

肩袖損傷后往往伴有肩關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，嚴(yán)重?fù)p害了患者的生活質(zhì)量.對(duì)于疼痛的準(zhǔn)確原因目前還存在爭(zhēng)議.我們認(rèn)為肩關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)是疼痛的重要原因之一.炎癥是機(jī)體對(duì)體內(nèi)外物理化學(xué)等傷害性刺激引起的損傷所發(fā)生的防御反應(yīng)，致炎因素引起組織局部血管擴(kuò)張、充血、血漿蛋白外滲等炎癥反應(yīng)的同時(shí)也導(dǎo)致大量的炎癥介質(zhì)釋放引起疼痛[21-22].本研究針對(duì)性地選擇IL-1β、IL-6以及TNF-α等3種典型炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)，研究其表達(dá)情況及其與大鼠疼痛的相關(guān)性.其中IL-1β能夠協(xié)調(diào)白細(xì)胞、免疫細(xì)胞和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過(guò)傳遞細(xì)胞信息影響造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22-23].TNF-α可以刺激白細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等快速聚集，活化核因子-κB(nuclear fac-tor-κB,NF-κB)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)更多的致炎因子生成，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生.本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后兩組大鼠肩關(guān)節(jié)液中的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平都比較高，這是由于手術(shù)創(chuàng)傷所引起的.但隨后假手術(shù)組的表達(dá)水平迅速降低，而手術(shù)組大鼠由于肩袖損傷導(dǎo)致3個(gè)炎性因子的表達(dá)水平有所下降，但依然較高.進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)上述3種典型炎癥因子的表達(dá)水平與大鼠疼痛成正相關(guān)，從而證明肩袖損傷與局部的炎癥反應(yīng)是引起患者疼痛的主要原因.由此可見(jiàn)，肩關(guān)節(jié)液相關(guān)因子的檢測(cè)可以作為患者病情變化的預(yù)測(cè)方法.

綜上所述，本研究證實(shí)大鼠肩袖損傷疼痛與關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α 3種炎癥因子之間成正相關(guān)，肩袖損傷后局部的炎癥反應(yīng)加重了疼痛癥狀.隨著肩袖的愈合，關(guān)節(jié)液中的炎癥因子表達(dá)逐漸減少，炎癥反應(yīng)和大鼠疼痛表現(xiàn)明顯緩解.本研究結(jié)果為肩袖損傷疼痛和關(guān)節(jié)液炎癥反應(yīng)提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)，也提示該炎癥因子可以作為肩袖損傷疼痛療效評(píng)價(jià)的客觀依據(jù).