三葉青根多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

王斌, 成亞飛, 武杰, 李剛磊, 王世明

(山西醫(yī)科大學(xué) 第一醫(yī)院 普通外科, 山西 太原 030000)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率[1].近年來，盡管隨著肝癌診斷和治療技術(shù)的提高，患者預(yù)后有了較大改善，但仍有部分患者體內(nèi)腫瘤易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，極大地威脅著患者健康[2].因此，尋找有效的肝癌治療藥物對(duì)于肝癌的治療具有重要意義.三葉青是一種江浙地區(qū)傳統(tǒng)的中藥，主要活性成分包括黃酮、多糖、山奈酚等，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)功效[3-5].三葉青根多糖(polysaccharides from roots ofRadixTetrastigma，RTP)是從三葉青塊根中提取得到的多糖，研究顯示，其可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6].目前，三葉青根多糖對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還尚未可知，故本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，探討三葉青根多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能的作用機(jī)制，以期為肝癌治療藥物的研發(fā)提供一定的新方向.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

肝細(xì)胞L-02購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；三葉青根購(gòu)自上饒市紅日農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，三葉青根多糖參照文獻(xiàn)[7]方法提取；胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭生物科技股有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶和噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海復(fù)申生物科技有限公司；miR-151模擬物(mimics)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-151抑制劑(anti-miR-151)和陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)購(gòu)自上海GenePharma公司；PCR引物序列購(gòu)自上海生工生物工程公司；鼠抗人P21、CyclinD1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人Bcl-2、鼠抗人Bax單克隆抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；鼠抗人MMP2、Ecadherin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ZYMED公司.

VICTOR Nivo型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司，ZF-258型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司，ABI 7500型Realtime PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肝細(xì)胞L-02和肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)方法相同，均用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%左右時(shí)，胰蛋白酶消化，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng).

1.2.2 篩選RTP作用的質(zhì)量濃度和時(shí)間

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞L-02和肝癌細(xì)胞HepG2，調(diào)整密度為2.5×104/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL.肝細(xì)胞L-02分為對(duì)照組(Con組)和不同質(zhì)量濃度的RTP組，Con組細(xì)胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同質(zhì)量濃度的RTP組細(xì)胞分別用含質(zhì)量濃度為0.65、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)[6].分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT檢測(cè)肝細(xì)胞L-02增殖情況，以RTP組與Con組細(xì)胞吸光度值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表示此質(zhì)量濃度的RTP對(duì)肝細(xì)胞L-02無毒性，篩選出對(duì)肝細(xì)胞L-02無毒性的RTP質(zhì)量濃度.HepG2細(xì)胞分為Con組和RTP組，Con組細(xì)胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，RTP組細(xì)胞加入對(duì)肝細(xì)胞L-02無毒性質(zhì)量濃度的RTP培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖，篩選出RTP對(duì)HepG2細(xì)胞的最佳作用質(zhì)量濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL的MTT溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h.棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，充分振蕩，待結(jié)晶紫溶解完全后，混合均勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度吸光度值D(490nm).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書，分別將anti-miR-151、anti-miR-NC、miR-151 mimics及miR-NC轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基.qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-151表達(dá)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果.繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.5 HepG2細(xì)胞分組

未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞分為Con組和RTP組，Con組用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，RTP組用含最佳質(zhì)量濃度RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng).轉(zhuǎn)染anti-miR-151、anti-miR-NC的細(xì)胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為anti-miR-151組和anti-miR-NC組.轉(zhuǎn)染miR-151 mimics、miR-NC的細(xì)胞用含最佳質(zhì)量濃度RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為RTP+miR-151組和RTP+miR-NC組.

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞，調(diào)整密度為2.5×105/mL，接種于24孔板中.細(xì)胞貼壁后，按照1.2.5分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞.取1×106個(gè)細(xì)胞，PBS清洗后，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞.加入10 μL的Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)10 min.再加入5 μL的碘化丙啶，室溫避光反應(yīng)10 min.加入400 μL結(jié)合緩沖液混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡.

1.2.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/mL.取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基.按照1.2.5分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，吸棄培養(yǎng)液.經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，棉簽擦去未遷移細(xì)胞，PBS清洗.顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù).

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前，先在上室鋪設(shè)Matrigel基質(zhì)膠(Matrigel與RPMI 1640培養(yǎng)基以體積比為1∶8的比例稀釋)，自然晾干.然后在加入100 μL細(xì)胞懸液，剩余操作與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同.

1.2.8 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度.選取D(260nm)/D(280nm)處于1.8～2.0范圍內(nèi)溶液，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán).引物序列見表1.miR-151以U6為內(nèi)參，P21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2均以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-151及P21，CyclinD1，Bcl-2，Bax,E-cadherin和MMP-2的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平.

表1 引物序列

1.2.9 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心后收集上清液，BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度.取適量蛋白溶液，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min.蛋白變性后，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，將其置于質(zhì)量濃度為5%的脫脂奶粉溶液中封閉1 h.TBST洗膜后，分別加入一抗P21(VP21∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、Cyclin D1(VCyclin D1∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、Bcl-2(VBcl-2∶V抗體稀釋液=1∶800)、Bax(VBax∶V抗體稀釋液=1∶800)、E-cadherin(VE-cadherin∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、MMP-2(VMMP-2∶V抗體稀釋液=1∶1 000)和GAPDH(VGAPDH∶V抗體稀釋液=1∶2 000)，4 ℃孵育過夜.次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶5 000)，室溫孵育1 h.TBST洗膜后，加入ECL顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照.以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平.目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平以其條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RTP作用的質(zhì)量濃度和時(shí)間的篩選

與Con組肝細(xì)胞L-02比，低質(zhì)量濃度(0.65、1.25、2.5 mg/mL)的RTP對(duì)抑制肝細(xì)胞L-02細(xì)胞活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而高質(zhì)量濃度(5、7.5、10 mg/mL)的RTP可抑制肝細(xì)胞L-02活性(P<0.05)，因此選擇0.65、1.25、2.5 mg/mL的RTP作為對(duì)HepG2細(xì)胞作用的最佳質(zhì)量濃度.與Con組比，RTP組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h后的活性、培養(yǎng)48 h后細(xì)胞中增殖相關(guān)因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，腫瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2細(xì)胞增殖(圖1).質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的RTP作用于HepG2細(xì)胞48 h時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率接近50%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇RTP的作用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL，作用時(shí)間為48 h.

A: RTP對(duì)肝細(xì)胞L-02活性的影響；B：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響；C：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞Cyclin D1和P21 mRNA表達(dá)的影響；D：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞Cyclin D1和P21蛋白的表達(dá)的影響.1)與Con組比較，P<0.05；2)與RTP 0.65 mg/mL組比較，P<0.05；3)與RTP 1.25 mg/mL組比較，P<0.05.

2.2 RTP對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的影響

與Con組比，RTP組HepG2細(xì)胞凋亡率、促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關(guān)因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關(guān)因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡(圖2).

A：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響；B：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的影響，×200; C：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表達(dá)的影響; D：RTP對(duì)HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)的影響.1)與Con組比較，P<0.05.

2.3 RTP對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)的影響

與Con組比，RTP組HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，表明RTP可降低HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)(表2).

表2 RTP對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)的影響

2.4 抑制miR-151對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

anti-miR-151組miR-151水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明miR-151抑制劑轉(zhuǎn)染成功，HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)被抑制(表3).與anti-miR-NC組比，anti-miR-151組HepG2細(xì)胞活性、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及增殖相關(guān)因子Cyclin D1、抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關(guān)因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，HepG2細(xì)胞凋亡率及腫瘤抑制因子P21、促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關(guān)因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明抑制miR-151可抑制HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡(圖3).

A：抑制miR-151對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；B：抑制miR-151對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響；C：抑制miR-151對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響，×200；D：抑制miR-151對(duì)Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表達(dá)的影響；E：抑制miR-151對(duì)Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的蛋白表達(dá)的影響.1)與anti-miR-NC組比較，P<0.05.

表3 抑制HepG2細(xì)胞miR-151表達(dá)的驗(yàn)證情況

2.5 過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞增殖的影響

與RTP+miR-NC組比，RTP+miR-151組HepG2細(xì)胞活性和增殖相關(guān)因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)，腫瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，表明過表達(dá)miR-151逆轉(zhuǎn)了RTP對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖的抑制作用(圖4、表4).

A：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞增殖的影響；B：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞Cyclin D1和P21的mRNA表達(dá)的影響; C：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞Cyclin D1和P21的蛋白表達(dá)的影響.1)與Con組比較，P<0.05；2)與RTP+miR-NC組比較，P<0.05.

表4 過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞miR-151表達(dá)的影響

2.6 過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的影響

與RTP+miR-NC組比，RTP+miR-151組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關(guān)因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，HepG2細(xì)胞凋亡率及促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關(guān)因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明過表達(dá)miR-151逆轉(zhuǎn)了RTP對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用(圖5).

A：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響,×200；B：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞凋亡的影響；C:過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞中E-cadherin和MMP-2的mRNA表達(dá)的影響;D：過表達(dá)miR-151對(duì)RTP作用的HepG2細(xì)胞中E-cadherin和MMP-2的蛋白表達(dá)的影響.

3 討論

細(xì)胞增殖紊亂可誘發(fā)腫瘤[8].Cyclin D1是參與細(xì)胞周期調(diào)控和維持細(xì)胞正常增殖的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[9].P21基因是目前已被證實(shí)的腫瘤抑制因子，其表達(dá)升高可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10].本研究結(jié)果顯示，三葉青根多糖可能通過上調(diào)P21蛋白表達(dá)和下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞的增殖.細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞自主生理性死亡，對(duì)機(jī)體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定具有極其重要的作用，細(xì)胞凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的一種手段[11].促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族中重要成員.Bax表達(dá)的升高或Bcl-2表達(dá)的降低可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12].本研究結(jié)果顯示，三葉青根多糖作用后，HepG2細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，提示三葉青根多糖可能通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡.腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因.基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[13].上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過程，上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的主要標(biāo)志性蛋白，其所介導(dǎo)的上皮細(xì)胞間的黏附可有效地抑制腫瘤的細(xì)胞遷移和侵襲[14].本研究結(jié)果顯示，三葉青根多糖可能通過上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)和下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力.

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程[15-16]，可作為抑癌或癌因子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17].研究顯示，miR-151在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，其高表達(dá)與PTC患者病灶數(shù)量、局部侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期等臨床病理特征密切相關(guān)[18]；miR-151高表達(dá)的前列腺癌患者存活率較低[19]；肝癌組織中miR-151表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[20].本研究結(jié)果顯示，抑制miR-151表達(dá)可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，這與Ding等[21]報(bào)道的肝細(xì)胞癌中miR-151表達(dá)增加，miR-151過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移結(jié)果一致，提示miR-151作為促癌基因參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展，是肝癌治療的潛在分子靶點(diǎn).研究顯示，黃芪-莪術(shù)可通過下調(diào)miR-151表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[22].白藜蘆醇可通過下調(diào)miR-151表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[23].為了探討三葉青根多糖發(fā)揮抗肝癌作用的分子機(jī)制，本研究采用qRT-PCR檢測(cè)了三葉青根多糖對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-151表達(dá)的影響，結(jié)果顯示三葉青根多糖可抑制HepG2細(xì)胞中miR-151的表達(dá).此外，過表達(dá)miR-151表達(dá)逆轉(zhuǎn)了三葉青根多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，提示三葉青根多糖可能通過下調(diào)miR-151表達(dá)影響HepG2細(xì)胞的生物學(xué)行為.

綜上所述，三葉青根多糖可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡，可能與下調(diào)細(xì)胞中miR-151表達(dá)有關(guān).本實(shí)驗(yàn)也存在一定的不足之處，接下來將進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討三葉青根多糖對(duì)肝癌腫瘤生長(zhǎng)的影響，為肝癌治療藥物的研發(fā)提供新方向.