香芋皮多酚的超聲提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

陳 嫣,段振華,*,劉 艷,段秋霞,唐美玲,段偉文,唐小閑

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,廣西賀州 542899)

香芋(Colocasiaesculenta)又名地栗子、檳榔芋,屬天南星科魁芋屬植物,是熱帶潮濕地區(qū)普遍種植的根莖類經(jīng)濟(jì)作物,既可食用又可藥用,含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,還含有多糖、酚類等活性物質(zhì),具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、健胃清腸、抗腫瘤和降血脂等功效[1-2]。我國南方特別是廣西地區(qū)香芋資源極豐富,且銷售價(jià)格低廉,可作為輔料加入食品,如廣西特色香芋扣肉,也可直接對其進(jìn)行加工,廣泛用于面包、蛋糕、脆片、冰淇淋、固體飲料、酸奶、調(diào)味品等食品中[3]。近年來隨著香芋加工不斷發(fā)展,香芋在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物[4],主要是香芋皮。工廠很少對香芋皮進(jìn)行利用,大多數(shù)將其當(dāng)成肥料,有些甚至丟棄,這直接影響了香芋的加工利用率,造成資源浪費(fèi)。目前對香芋副產(chǎn)物香芋皮的研究甚少,陳秋娟等[5-7]研究了改性香芋皮粉末對Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)、Pb2+的吸附性能,將香芋皮應(yīng)用于吸附廢水中的重金屬離子,對改善環(huán)境有著積極的影響;施帥等[8]研究微波輔助提取芋頭生物堿工藝,但并沒有深入研究芋頭皮生物堿的作用;朱憲龍等[9]用超聲波輔助提取檳榔芋皮的生物堿并研究其抑菌性質(zhì)。研究表明在香芋皮中發(fā)現(xiàn)的活性成分為生物堿,而香芋皮中其他的組成成分尚未有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道,值得深入研究。因此研究香芋皮中的活性成分及其作用對香芋副產(chǎn)物的利用有重要意義。

香芋皮中生物堿的提取為香芋皮活性成分的提取提供了一定的參考。雖然香芋皮中其他活性成分的提取未見報(bào)道,但多酚在多種植物中廣泛存在,且植物中皮、根、葉和果等部位中大都含有植物多酚[10]。王佳宏[11]的研究也表明了芋頭中含有較多的多酚類物質(zhì),特別是近周皮部位。多酚類成分在抗氧化方面有著良好的效果,它可以有效的清除人體產(chǎn)生的自由基,以達(dá)到抗氧化、延緩衰老的目的,是安全有效的天然抗氧化劑[12-15],但目前尚未見到從香芋皮中提取多酚的研究。本文利用超聲波所產(chǎn)生的空化和熱效應(yīng)等特殊作用,能將多酚快速高效地提取出來[16-18]。因此本研究以香芋加工副產(chǎn)物香芋皮為原料,采用超聲輔助提取香芋皮多酚,并對抗氧化活性進(jìn)行研究,有助于揭示香芋皮具有的保健功能,為香芋副產(chǎn)物活性物質(zhì)的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香芋 購于賀州百家福超市;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、六水合三氯化鐵、無水乙醇、抗壞血酸 分析純,廣東光華科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基 分析純,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽 生物試劑,合肥博美生物科技有限公司;福林酚 生物試劑,上海源葉生物科技有限公司;無水碳酸鈉 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;沒食子酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀 分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;過硫酸鉀 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

PTX-FA110S電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;RE311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本雅馬拓(YAMATO);XH-300B微波超聲組合萃取儀 北京祥鵠科技有限公司;UV-1780紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香芋皮多酚的提取工藝 將購買的香芋洗凈,用削皮刀削皮,厚度在1～2 mm,收集廢棄香芋皮放在60 ℃干燥箱中恒溫烘干,粉碎后過60目篩,貯于干燥避光處備用。按照一定料液比,精密稱取香芋皮粉末1.000 g,按照工藝研究中的不同參數(shù)設(shè)定超聲提取條件進(jìn)行多酚的提取,離心,上清液即為多酚溶液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 超聲功率對香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定乙醇濃度為70%,料液比為1∶30 g/mL,提取時(shí)間為20 min,分別在100、200、300、400、500 W超聲功率的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同超聲功率對香芋皮多酚得率的影響,確定較佳超聲功率。

1.2.2.2 乙醇濃度對香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,料液比為1∶30 g/mL,提取時(shí)間為20 min,分別在30%、40%、50%、60%、70%乙醇濃度的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同乙醇濃度對香芋皮多酚得率的影響,確定較佳乙醇濃度。

1.2.2.3 料液比對香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,乙醇濃度50%,提取時(shí)間20 min,分別在1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL料液比的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同料液比對香芋皮多酚得率的影響,確定較佳料液比。

1.2.2.4 超聲時(shí)間對香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,乙醇濃度50%,料液比1∶50 g/mL,分別在10、20、30、40、50 min超聲時(shí)間的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同超聲時(shí)間對香芋皮多酚得率的影響,確定較佳超聲時(shí)間。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為了多方面的分析不同因素間的相互作用對超聲輔助提取香芋皮多酚的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果選擇正交表L9(34)對香芋皮中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究,正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 香芋皮多酚得率的測定

1.2.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照文獻(xiàn)[19]的方法,略作修改。精確稱取0.2500 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水溶解并定容到50 mL棕色容量瓶中,取1 mL用蒸餾水定容到100 mL,得到質(zhì)量濃度為50 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于8個(gè)10 mL容量瓶中,再分別加入2 mL福林酚試劑,振蕩搖勻,在0.5～8 min內(nèi)加入2.5 mL 12% Na2CO3溶液,反應(yīng)30 s后用蒸餾水定容,室溫避光反應(yīng)2 h,用蒸餾水作空白對照,在765 nm下測定其吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo),沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到?jīng)]食子酸在濃度0～7 μg/mL內(nèi)與其吸光值呈良好的線性關(guān)系,得到線性回歸方程y=0.13112x+0.00772,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

1.2.4.2 多酚得率計(jì)算 精密量取提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中,按1.2.4.1所述的方法測定提取液的吸光值,將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計(jì)算出樣品液中多酚的濃度,代入下式中計(jì)算出1.000 g香芋皮粉末中多酚類物質(zhì)的含量(以沒食子酸計(jì),mg/g),計(jì)算公式如式(1)所示。

式(1)

式中:X表示香芋皮多酚得率,mg/g;C表示樣品液中多酚的濃度,μg/mL;V表示提取液的總體積,mL;m表示稱取的香芋皮粉的質(zhì)量,g。

1.2.5 抗氧化活性測定 將1.2.1提取出多酚溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測定其濃度,最后稀釋成適當(dāng)濃度進(jìn)行抗氧化活性測定。

1.2.5.1 總還原能力的測定 參照文獻(xiàn)[20]測定2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液在700 nm處的吸光度值,吸光度值越高表明其總還原能力越強(qiáng)。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的測定 參照文獻(xiàn)[21]在517 nm處測定0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液對DPPH自由基的清除能力,計(jì)算清除率。計(jì)算公式見式(2)。

式(2)

式中:Ai表示2.0 mL樣品液與2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液的吸光度值;Aj表示2.0 mL樣品液與2.0 mL無水乙醇的吸光度值;A0表示2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS自由基清除率測定 參照文獻(xiàn)[22]在734 nm處測定0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液對ABTS自由基的清除能力,計(jì)算清除率。計(jì)算公式見式(3)。

式(3)

式中:Ai表示0.1 mL樣品液與3.9 mL ABTS溶液的吸光度值;Aj表示0.1 mL樣品液與3.9 mL 10 mmol/L磷酸緩沖溶液的吸光度值;A0表示0.1 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液與3.9 mL ABTS溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作,運(yùn)用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和圖形繪制,測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)IC50來判斷其抗氧化能力,IC50值越小,樣品抗氧化活性越強(qiáng)[23]。IC50的定義為:使得自由基的清除率達(dá)到50%時(shí)需要的樣品液的濃度,通過SPSS 20.0求出IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對香芋皮多酚得率的影響

由圖1知,在超聲功率100～200 W范圍時(shí),超聲波功率對香芋皮多酚得率的影響不大,這是因?yàn)樾」β史秶鷥?nèi)超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)和能量較小,不能有效破壞組織細(xì)胞,功率在200 W以下時(shí)對多酚得率幾乎無影響。超聲功率從200 W提升至400 W時(shí),香芋皮多酚得率逐漸提高,在400 W時(shí)達(dá)到最大值。超聲功率繼續(xù)增大時(shí),多酚得率開始下降,這主要是由于超聲功率增加,超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)使體系溫度升高,促使細(xì)胞破裂,分子擴(kuò)散、滲透和溶解速度加快,有利于多酚物質(zhì)的浸出[24],但功率過大時(shí)會(huì)使多酚結(jié)構(gòu)破壞,雜質(zhì)溶出過多,使多酚得率降低[25]。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取350、400、450 W的超聲功率為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖1 超聲功率對香芋皮多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.2 乙醇濃度對香芋皮多酚得率的影響

由圖2可知,乙醇濃度對多酚提取效果影響較大,整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)得率達(dá)到最大值,乙醇濃度超過50%后,香芋皮多酚得率開始迅速下降,這可能是由于香芋皮中存的多酚與50%乙醇極性相同,有機(jī)溶劑與水的混合液可以打斷多酚類物質(zhì)-蛋白質(zhì)(多糖)復(fù)合物的結(jié)合鍵,從而釋放多酚物質(zhì)[26]。但高濃度乙醇使細(xì)胞膜變性,導(dǎo)致多酚不能很好的溶解出來[27],另外一些醇溶性雜質(zhì)的溶出也會(huì)與多酚競爭與乙醇結(jié)合,造成多酚含量降低。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取45%、50%、55%的乙醇濃度為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖2 乙醇濃度對香芋皮多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.3 料液比對香芋皮多酚得率的影響

由圖3可知,隨著料液比增大,香芋多酚得率呈逐漸上升趨勢,當(dāng)料液比到達(dá)1∶50 g/mL時(shí)出現(xiàn)峰值,之后趨于平緩。這是因?yàn)榱弦罕冗^低,溶液已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài),不利于提取物溶出,提取不完全。料液比的不斷增加,增大了香芋皮粉末與溶劑的接觸面積,增大細(xì)胞壁內(nèi)外的物質(zhì)的擴(kuò)散速度,加快了多酚的溶出[28],但由于在一定質(zhì)量的香芋皮粉里所含的多酚類物質(zhì)有限,所以在料液比1∶50 g/mL之后多酚在溶劑中的得率達(dá)到飽和狀態(tài),再加大料液比并不能顯著提高多酚的得率,而且耗費(fèi)溶劑量變多,也會(huì)造成浪費(fèi)。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取1∶45、1∶50、1∶55 g/mL的料液比為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖3 料液比對香芋皮多酚得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.4 超聲時(shí)間對香芋皮多酚得率的影響

由圖4可知,在小于30 min時(shí),多酚得率呈上升的趨勢,這是由于超聲波獨(dú)具的物理性質(zhì)能夠促使植物細(xì)胞組織破壁或變形,使多酚物質(zhì)溶出,但提取時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致提取不充分,提取30 min時(shí)香芋皮多酚的得率達(dá)到最佳。當(dāng)時(shí)間超過30 min時(shí),隨著時(shí)間增長,超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)逐漸累積[29],強(qiáng)烈的熱效應(yīng)會(huì)使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,時(shí)間過長也會(huì)使多酚類物質(zhì)被氧化分解[30],導(dǎo)致多酚得率下降。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取25、30、35 min超聲時(shí)間為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖4 超聲時(shí)間對香芋皮多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇超聲功率、乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),以確定提取香芋皮多酚的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2中R1、R2、R3、R4可知4個(gè)因素對香芋皮多酚得率的影響程度依次為:B(乙醇濃度)>C(料液比)>A(超聲功率)>D(超聲時(shí)間),即最顯著的影響因素是乙醇濃度,超聲時(shí)間的影響最不顯著。正交試驗(yàn)得到香芋皮多酚得率的最佳提取工藝組合為A2B1C3D3,即超聲功率400 W,乙醇濃度45%,料液比1∶55 g/mL,超聲時(shí)間35 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于最佳組合沒有在正交表的組合中,所以按照k值計(jì)算法得到的最佳組合A2B1C3D3做驗(yàn)證試驗(yàn),在該工藝下進(jìn)行五次平行試驗(yàn)得到平均值為(23.61±0.36) mg/g,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%。驗(yàn)證試驗(yàn)所得結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)表中任意一個(gè)組合的得率,說明經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的提取工藝組合較為可靠。

2.7 抗氧化活性測定試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 總還原能力的測定結(jié)果 由圖5可知,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)香芋皮多酚的總還原能力隨著濃度的增加而增強(qiáng),存在良好的線性關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系[31],當(dāng)濃度為20.0 μg/mL時(shí)香芋皮多酚的還原能力為0.4431±0.0027。在所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),可以看出香芋皮多酚的總還原能力略高于VC,但明顯低于沒食子酸。

圖5 還原能力試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of reduction capacity

2.7.2 DPPH自由基清除率的測定 由圖6可知,香芋皮多酚、VC和沒食子酸在較低的濃度范圍就有很好的DPPH自由基清除能力,并隨著濃度的增大而增強(qiáng),香芋皮多酚在濃度小于12.5 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,當(dāng)濃度達(dá)到12.5 μg/mL之后變化趨于緩慢,IC50為(5.6647±0.2545) μg/mL;VC在濃度小于15.0 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,濃度達(dá)到15.0 μg/mL之后變化趨于緩慢直至基本不變,IC50為(6.9018±0.0470) μg/mL;沒食子酸在濃度小于5.0 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)線性關(guān)系,大于5.0 μg/mL時(shí)變化趨于緩慢直至基本不變,IC50為(1.6843±0.2025) μg/mL。由IC50大小判斷出香芋皮多酚DPPH自由基清除率高于VC但是遠(yuǎn)小于沒食子酸。在20.0 μg/mL時(shí)香芋皮多酚、VC和沒食子酸的DPPH清除率達(dá)到87.7179%±0.1419%、93.7033%±0.1130%和93.7192%±0.1132%,綜合IC50值可以得出,香芋皮多酚對DPPH自由基有較好的清除效果。

圖6 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of DPPH free radical scavenging capacity

2.7.3 ABTS自由基清除率測定 由圖7可知,香芋皮多酚、VC和沒食子酸對ABTS自由基的清除能力都是隨著底物濃度的增大而增強(qiáng),香芋皮多酚、VC和沒食子酸分別在濃度小于100、160、40 μg/mL時(shí)與ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,之后變化趨于緩慢基本不變。計(jì)算出IC50分別為(36.3630±2.4013)、(61.6051±0.9560)、(14.5621±0.1483) μg/mL,由IC50判斷出ABTS自由基的清除率大小順序?yàn)闆]食子酸>香芋皮多酚>VC。在160 μg/mL時(shí)香芋皮多酚、VC和沒食子酸的ABTS清除率均達(dá)到99%以上,無顯著差異。香芋皮多酚ABTS自由基清除率最大可達(dá)到99.8242%±0.0718%。綜上,香芋皮多酚對ABTS自由基有較好的清除能力。

圖7 ABTS自由基清除試驗(yàn)Fig.7 Results of ABTS free radical scavenging capacity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對提取香芋皮多酚的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,影響香芋皮多酚得率主次因素依次為:乙醇濃度>料液比>超聲功率>超聲時(shí)間,其中最顯著的影響因素是乙醇濃度;超聲提取香芋皮中多酚的最佳工藝條件為超聲功率400 W,乙醇濃度45%,料液比1∶55 g/mL,超聲時(shí)間35 min,此條件下香芋皮中多酚得率達(dá)到(23.61±0.36) mg/g。

抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,在最佳條件下提取得到的香芋皮多酚具有一定的還原能力,對DPPH自由基和ABTS自由基清除作用均表現(xiàn)出良好的清除效果,相應(yīng)的IC50值分別為(5.6647±0.2545)和(36.3630±2.4013) μg/mL。