碳酸二甲酯三相分配體系萃取分離螺旋藻多糖

羅光宏，雷婕，張喜峰1,*，敬麗娜，王鑫鑫，楊生輝，張青婷

1(河西學(xué)院 甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 張掖，734000)2(甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖，734000)3(河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖，734000)

螺旋藻(Spirulinaplatensis)又稱鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospiraplatensis)，是一種藍(lán)綠藻，其含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、必需脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)和色素，如類胡蘿卜素、葉綠素和藻藍(lán)蛋白等[1-2]。多糖作為最重要活性成分之一，受到國內(nèi)外研究學(xué)者極大關(guān)注，其具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等多種生物活性和功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。天然多糖通常采用浸漬、熱回流提取，經(jīng)脫蛋白、脫色、透析等一系列分離程序，再經(jīng)柱層析得到高純度的多糖。然而，上述操作和工藝存在耗時長、能耗高、成本昂貴，使用有毒溶劑，對人體健康和環(huán)境有害。因此，不利于在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

目前，三相分配體系(three-phase partitioning,TPP)作為一種簡便、快速和綠色的萃取方法已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中多糖、蛋白質(zhì)、酶、酶抑制劑、油脂和小分子等提取和分離[7-8]。此外，該技術(shù)在室溫下易于大規(guī)模進(jìn)行，因此適用于對溫度敏感的生物活性分子提取和分離[9]。在典型的TPP體系中，硫酸銨作為無機(jī)鹽相，叔丁醇作為有機(jī)相，通常用于從粗提物或懸浮液中分離生物活性分子[8,10-11]。叔丁醇由于其高沸點(diǎn)、低可燃性以及顯著地促進(jìn)水分子締合和擁擠效應(yīng)[10]而被廣泛應(yīng)用于TPP。盡管叔丁醇對皮膚和眼睛有一定的毒性和刺激性，但仍被廣泛應(yīng)用于各種TPP體系[12]。與叔丁醇相比，碳酸二甲酯具有較低的皮膚刺激性和毒性[13-14]，被認(rèn)為是一種較為綠色的溶劑[15-16]。PANADARE等[17]使用碳酸二甲酯作為叔丁醇的替代溶劑，建立了一種以碳酸二甲酯為有機(jī)相、檸檬酸鈉為鹽相的新型TPP體系，用于苦瓜過氧化物酶的提取和純化。近年來，本課題組利用叔丁醇、硫酸銨三相體系從螺旋藻多糖粗提液中萃取分離螺旋藻多糖(polysaccharides ofSpirulinaplatensis,PSP)[18]。然而，目前尚未有研究報道基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的新型TPP萃取分離PSP。

因此，本研究以碳酸二甲酯為有機(jī)相，檸檬酸鈉為鹽相，采用新型TPP萃取分離PSP，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化，研究了碳酸二甲酯與粗提液體積比、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度、溫度和pH值等提取工藝參數(shù)對PSP和蛋白質(zhì)含量的影響，并與叔丁醇和硫酸銨形成TPP制備的PSP理化性質(zhì)和體外抗氧化活性進(jìn)行了比較研究。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

螺旋藻，甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心。

課題組前期研究[18]所用叔丁醇和硫酸銨的TPP體系制備的PSP,在本研究中命名為PSP-T。

碳酸二甲酯、檸檬酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖均為分析純。透析袋(分子截留量8～12 kD)，單糖標(biāo)準(zhǔn)品(D-來蘇糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和D-木糖)、三氟乙酸,成都德思特生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸((R)-(+)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)、H2O2、2，2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2，2′-azino-bisc3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)，上海源葉生物科技有限公司。

PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Alpha-1860Plus紫外可見分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；GC-MS6800氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司；GPC-IR高溫凝膠滲透色譜儀，北京億路達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司；Nicolet iS50紅外光譜儀，美國Thermo Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻多糖粗提液的制備

參照前期研究方法制備螺旋藻多糖粗提液[18]。

1.2.2 基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP萃取PSP

采用碳酸二甲酯為有機(jī)相，檸檬酸鈉為鹽相，參考PANADARE等[17]，略作改動。將給定量的檸檬酸鈉(0.1～0.5 g/mL)加入10 mL多糖粗提液中，攪拌溶解后，加入2.5～20 mL碳酸二甲酯。隨后，將混合物置于20～40 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中30 min，4000 r/min離心10 min，形成透明相。收集下相，在蒸餾水中透析48 h(MWCO:8 k～12kDa)，凍干得到部分純化的PSP-D，考察碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度(g/mL)、溫度、pH值對PSP-D萃取效果的影響。通過添加1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH水溶液，調(diào)整體系pH值。PSP-D的萃取得率采用公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：m,為螺旋藻粉末質(zhì)量;ρ和V分別為PSP在下相中的質(zhì)量濃度和體積。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化三相萃取條件

采用響應(yīng)面中Box-Behnken設(shè)計(jì)(Box-Behnken design,BBD)，優(yōu)化碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比(A)、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度(B，g/mL)、溫度(C，℃)和pH(D)操作參數(shù)對TPP工藝的影響。以4個因素為自變量，以PSP-D的萃取得率(Y，%)為響應(yīng)值。

表1為整個實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及自變量和測定響應(yīng)值。對BBD實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，通過以下二階多項(xiàng)式模型發(fā)現(xiàn)響應(yīng)函數(shù)與變量的相關(guān)性。

(2)

式中：Y,響應(yīng)值(PSP-D萃取得率，%);A0、Ai、Aii和Aij分別為截距項(xiàng)、線性項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的變量系數(shù)(i≠j)。采用Design Expert V8.0.6.1 軟件對RSM優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 理化性質(zhì)分析

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[19]。

三氟乙酸分別水解PSP-D和PSP-T，衍生化后，用氣相色譜法測定其單糖組成。單糖標(biāo)準(zhǔn)品也按照上述步驟進(jìn)行測定。

采用高效尺寸排阻色譜法(high performance size-exclusion chromatography,HPSEC)結(jié)合多角度激光散射(Multi-angle laser light scattering, MALLS，DAWN HELLOS II λ=658 nm)測定平均分子量(Mw)，PSP-D和PSP-T的分子質(zhì)量(Mn)和分子質(zhì)量分布(Mw/Mn)。

采用傅里葉變換-紅外光譜(Fourier transform infrared spectrossopy,FTIR)對干燥后PSP-D和PSP-T與光譜純KBr顆粒研磨壓片后，在500～4 000 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)測定。

1.2.5 多糖體外抗氧化活性測定

配制不同質(zhì)量濃度(0～2.0 mg/mL)的PSP-D和PSP-T多糖溶液，并以Vc作為陽性對照，在室溫下用UV-1601分光光度計(jì)測定吸光度。根據(jù)羥自由基(·OH)清除活性、DPPH自由基清除活性、Trolox當(dāng)量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力測定，比較二者的體外抗氧化活性[20]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果和分析

2.1 基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系制備PSP-D

以碳酸二甲酯為有機(jī)相，檸檬酸鈉為鹽相的TPP從螺旋藻多糖粗提液中提取PSP-D。研究了碳酸二甲酯與螺旋藻多糖粗提液體積比、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度、pH值和溫度對PSP-D的萃取得率的影響。

2.1.1 碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比對PSP-D萃取效果的影響

固定檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g/mL、pH值6.0和溫度25 ℃，圖1-a顯示了碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比(0.25∶1.0、0.5∶1.0、1.0∶1.0、1.5∶1.0和2.0∶1.0)對PSP-D萃取得率的影響。隨著碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比例的增加，PSP-D的萃取得率值呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢，當(dāng)碳酸二甲酯與多糖粗提液比例為0.5∶1.0時，PSP-D的萃取得率達(dá)到最高為61.30%。結(jié)果表明，碳酸二甲酯作為一種抗溶劑和促進(jìn)水分子締合劑在TPP中起著重要作用。碳酸二甲酯與檸檬酸鈉在水溶液中協(xié)同作用，通過改變水的結(jié)構(gòu)，可以形成較強(qiáng)的分子間鍵合。這不僅有助于增加水溶性多糖在溶液中溶解度，而且有助于大分子蛋白質(zhì)從下相中沉淀出來[17]。因此，隨著碳酸二甲酯用量的增加，富集在下相中的水溶性PSP-D增加，導(dǎo)致PSP-D的萃取得率增加；但碳酸二甲酯體積的增加會降低PSP-D的萃取得率，可能是由于碳酸二甲酯的促進(jìn)水分子締合和擁擠效應(yīng)所致。同時，隨著碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比的增加，下相中蛋白質(zhì)的含量逐漸下降。推測碳酸二甲酯體積的增加可以通過與沉淀蛋白的結(jié)合來增加沉淀蛋白的浮力，從而導(dǎo)致更多蛋白質(zhì)聚集在中間相，使下相中蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢，因此，確定碳酸二甲酯和多糖提取液體積比為0.5∶1.0，作為后續(xù)的萃取分離實(shí)驗(yàn)條件。

2.1.2 檸檬酸鈉質(zhì)量濃度對PSP-D萃取效果的影響

當(dāng)碳酸二甲酯與多糖粗提液比0.5∶1.0、pH 6.0和溫度25 ℃保持恒定時，研究檸檬酸鈉質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/mL)對下相中PSP-D的萃取得率和蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果如圖1-b所示。隨著檸檬酸鈉質(zhì)量濃度逐漸增加，PSP-D的萃取得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。檸檬酸鈉在TPP中具有鹽溶效應(yīng)，這可能有利于PSP-D在下相中的有效分配。然而，隨著檸檬酸鈉質(zhì)量濃度的不斷增加，檸檬酸鈉的鹽析效應(yīng)在TPP過程中起著重要作用。該效應(yīng)削弱了PSP-D與水分子在下相中形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，甚至破壞了氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而降低了PSP-D的萃取得率。同時，當(dāng)檸檬酸鈉質(zhì)量濃度從0.1 g/mL增加到0.5 g/mL時，可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢。在高質(zhì)量濃度下，檸檬酸鈉促進(jìn)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，更多的游離蛋白質(zhì)富集在中間相，導(dǎo)致下相中可溶性蛋白質(zhì)含量降低。因此，檸檬酸鈉質(zhì)量濃度0.2 g/mL被視為后續(xù)TPP試驗(yàn)的最佳鹽濃度。

a-碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比的影響; b-檸檬酸鈉質(zhì)量濃度的影響; c-溫度的影響； d-pH的影響圖1 不同參數(shù)對PSP-D萃取效果的影響Fig.1 Effects of different parameters on extraction yield of PSP-D in the lower aqueous phase

2.1.3 溫度對PSP-D萃取效果的影響

較高的溫度可以加速TPP過程中的傳質(zhì)速度。本文研究了溫度在20～40 ℃對PSP-D的萃取得率和蛋白質(zhì)含量的影響。如圖1-c所示，PSP-D的萃取得率隨溫度從20 ℃升高到40 ℃呈現(xiàn)先顯著升高后略有降低的趨勢；如COIMBA等[21]所述，TPP體系中溫度的升高有助于多糖的分子結(jié)構(gòu)暴露出更多親水羥基，這些羥基有助于形成強(qiáng)氫鍵或與水分子的連接，進(jìn)一步使下相富集更多的PSP-D。TAN等[22]研究結(jié)果表明，30 ℃的溫度有利于TPP同時純化蘆薈多糖和蛋白質(zhì)，提高了蘆薈多糖的提取率。然而，在較高溫度下，少量碳酸二甲酯可降低與檸檬酸鈉的協(xié)同效應(yīng)，從而使PSP-D的萃取得率降低。除了較低的促進(jìn)水分子締合和擁擠效應(yīng)外，碳酸二甲酯在較高溫度下的作用可以降低PSP-D的萃取得率。同時，隨著溫度的升高，下相中蛋白質(zhì)含量從2.21%下降至1.87%。因此，在本研究中，將溫度設(shè)置為30 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 pH對PSP-D萃取效果的影響

pH值作為一個重要因素可以影響大分子的電離基團(tuán)并改變其表面電荷。碳酸二甲酯與多糖粗提液比為0.5∶1.0、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g/mL、溫度為30 ℃，研究pH值對PSP-D萃取效果的影響。如圖1-d所示，在pH 6.0時，PSP-D的萃取得率最大，蛋白質(zhì)含量為1.76%。隨著pH值從6.0增加到8.0，PSP-D的萃取得率略有下降，蛋白質(zhì)含量略有增加；如前期研究所述，叔丁醇和硫酸銨組成的TPP體系的最佳pH值為7.0，這與現(xiàn)有的碳酸二甲酯和檸檬酸鈉組成的TPP體系相似[20]。因此，pH 6.0被認(rèn)為是PSP-D分配的最佳pH值。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.2.1 優(yōu)化TPP工藝參數(shù)

采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的4因子BBD優(yōu)化TPP工藝參數(shù)，以獲得PSP-D最大萃取得率。表1給出了工藝變量和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。PSP-D的萃取得率值在8.53%～12.05%，當(dāng)碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.5∶1.0、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，溫度為30 ℃，體系pH為6.0時，最大萃取得率為12.05%。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到以下二階多項(xiàng)式方程：

表1 三相分配法萃取分離螺旋藻多糖Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 1 Box-Behnken experimental design and the results for extraction yield of PSP-D from Spirulina platensis by using TPP

Y=11.752-0.091A-0.383B-0.120C+0.365D-0.063AB+0.653AC-0.323AD+0.258BC-0.013BD-0.006CD-1.430A2-0.938B2-0.812C2-1.120D2

(3)

表2 PSP-D萃取得率的二次多項(xiàng)式模型的回歸系數(shù)及其顯著性分析Table 2 Regression coefficient estimation and their significant analysis for the quadratic polynomial model of PSP-D yield

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面3D和2D等高線圖可反映響應(yīng)值與過程變量水平之間的關(guān)系以及2個變量之間的相互作用。結(jié)果如圖2所示，PSP-D的萃取得率隨2個變量的增大先增大后減小，在碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.00、溫度29.59 ℃時，PSP-D的萃取得率達(dá)到最大值，并且橢圓等高線圖進(jìn)一步表明碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比(A)和溫度(C)顯著，與表2的結(jié)果一致。

2.2.3 優(yōu)化條件驗(yàn)證

根據(jù)方差分析和響應(yīng)面圖對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，結(jié)果表明，基于現(xiàn)有TPP體系的PSP-D的優(yōu)化條件為：碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.00、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.177 9 g/mL和溫度29.59 ℃和pH 6.18。在此條件下，所建模型預(yù)測的PSP-D的最大萃取得率為11.84%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，對最佳工藝條件進(jìn)行了修正：碳酸二甲酯與多糖粗提液的體積比為0.6∶1.0，檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.18 g/mL，溫度為30 ℃，pH 6.0。為了驗(yàn)證RSM模型的可靠性，在改進(jìn)的優(yōu)化條件下進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，PSP-D的萃取得率為(11.90±0.12)%(n=3)，接近預(yù)測值(11.84%)。因此，基于響應(yīng)面的BBD被認(rèn)為是一種優(yōu)化TPP工藝條件的方法。

a-響應(yīng)面圖; b-等高線圖圖2 碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比和溫度相互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the effects of dimethyl carbonate to crude extract ratio and temperature on the extraction yield of PSP-D

2.3 PSP-D特性

表3總結(jié)了采用2種不同的TPP體系從螺旋藻多糖粗提液中制備的PSP-D和PSP-T的含量、單糖組成和分子量大小。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件獲得的PSP-D和PSP-T的萃取得率分別為11.90%和9.25%，說明用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉形成的TPP體系優(yōu)于叔丁醇和硫酸銨形成的TPP體系。PSP-D的多糖含量為87.49%，略高于PSP-T的86.17%。PSP-D蛋白質(zhì)含量低于PSP-T，說明以碳酸二甲酯為有機(jī)溶劑的TPP比以叔丁醇為溶劑的TPP更有助于分離富集多糖和蛋白質(zhì)，這進(jìn)一步證實(shí)了碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系分離富集多糖的優(yōu)越性。

如表3所示，PSP-D和PSP-T為雜多糖，由不同摩爾比的鼠李糖、甘露糖、葡萄糖組成。葡萄糖是PSP-D和PSP-T分子結(jié)構(gòu)中的主要單糖。結(jié)果表明，采用2種不同的TPP體系從螺旋藻多糖粗提液中提取的PSP-D和PSP-T具有不同的化學(xué)成分。根據(jù)HPSEC-MALLS分析，從含叔丁醇和硫酸銨的TPP體系中得到的PSP-T重均分子量Mw為3.597×104，數(shù)均分子量為Mn=2.189×104，Mw/Mn=1.643。從含碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP系統(tǒng)中得到的PSP-D重均分子量Mw為5.164×104，Mw/Mn=1.847。PSP-T的Mw和Mw/Mn值均低于PSP-D，說明在碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系中，PSP-D的解聚較少。

表3 不同三相體系萃取螺旋藻多糖的含量、單糖組成和分子量Table 3 Chemical compositions and physiochemical properties of PSP-D and PSP-T from Spirulina platensis by various TPP systems

圖3為PSP-D和PSP-T紅外光譜，二者具有相似的特征吸收峰，說明二者化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，在3 385(或3 394)cm-1處寬而強(qiáng)的峰和2 925(或2 929)cm-1處弱的峰分別歸因于O—H和C—H伸縮振動峰；1 652(或1 635)cm-1和1 385(或1 391)cm-1在1 000～1 200 cm-1范圍內(nèi)的強(qiáng)吸收帶是由于PSP-D和PSP-T中C—O—C和C—O—H基團(tuán)的拉伸振動引起的，此外，在約861(或858)cm-1處觀察到特征峰，這表明吡喃糖存在于α構(gòu)型中。

圖3 PSP-D和PSP-T紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of PSP-D and PSP-T

2.4 體外抗氧化活性

圖4顯示了PSP-D和PSP-T對DPPH自由基和·OH的清除能力及Trolox當(dāng)量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力。如圖4-a和圖4-b所示，PSP-D和PSP-T對DPPH自由基和·OH的清除能力隨質(zhì)量濃度從0 mg/mL增加到2.0 mg/mL呈劑量依賴性增加，在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，對DPPH和·OH的清除能力分別為85.42%和86.59%，略高于PSP-T(分別為82.19%和84.16%)，但均低于VC(分別為98.89%和98.45%)。PSP-D和PSP-T清除DPPH自由基的IC50分別為0.80和0.86 mg/mL，PSP-D和PSP-T清除·OH能力的IC50分別為0.72和0.78 mg/mL。結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，PSP-D具有更強(qiáng)的清除自由基能力。

如圖4-c所示，PSP-D的Trolox當(dāng)量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力分別為384.62 μmol Trolox/g和29.45 μmol Fe2+/g，略大于PSP-T(分別為372.59 μmol Trolox/g和23.56 μmol Fe2+/g)。結(jié)果表明，PSP-D具有比PSP-T更強(qiáng)的抗氧化能力，這與DPPH自由基和·OH清除能力的結(jié)果一致。這可能是由于PSP-D比PSP-T具有更高的多糖含量，從而有助于提高體外抗氧化活性。另外，單糖組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)和鏈構(gòu)象也與抗氧化活性有關(guān)[23]。綜上所述，用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉從現(xiàn)有TPP體系中獲得的PSP-D在體外表現(xiàn)出良好的自由基清除能力和抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除自由活性; b-·OH清除率; c-Trolox當(dāng)量抗氧化能力測定和鐵離子還原/抗氧化能力測定圖4 PSP-D和PSP-T樣品體外抗氧化活性Fig.4 In vitro antioxidant activities of the PSP-D and PSP-T

3 結(jié)論

本研究采用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉組成的TPP體系，從螺旋藻多糖粗提液中萃取分離PSP-D。在碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.0、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.18 g/mL、溫度30 ℃、pH 6.0的優(yōu)化條件下，PSP-D的最大萃取得率為(11.90±0.12)%，其含糖量高于叔丁醇和硫酸銨形成TPP制備的PSP-T。二者具有不同的化學(xué)組成和分子量，但其主要結(jié)構(gòu)特征沒有改變。此外，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，PSP-D比PSP-T具有更強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，因此，新形成的以碳酸二甲酯為溶劑的TPP體可取代叔丁醇為溶劑的TPP體系，可獲得較高得率和含量的多糖。