短小芽孢桿菌sRNA Bpsr112的鑒定及功能研究

覃 佳，徐云帆，黃 宇，王海燕

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065)

1 引 言

短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SCU11是一株經(jīng)過(guò)復(fù)合誘變的菌株，能夠通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)高效產(chǎn)生胞外蛋白酶，發(fā)酵液具有良好的生皮脫毛效果，在生物制革方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1,2].

細(xì)菌小RNA(small RNA，又稱(chēng)作sRNA)是一類(lèi)能夠轉(zhuǎn)錄，但通常不編碼蛋白質(zhì)的RNA，長(zhǎng)50-500 nt，大多數(shù)由基因組上的基因間隔區(qū)編碼，少數(shù)由基因編碼區(qū)的互補(bǔ)鏈編碼.

基因間隔區(qū)的sRNA主要通過(guò)不完全的堿基配對(duì)與靶基因的mRNA直接結(jié)合[3]，影響靶mRNA的翻譯[4]或者穩(wěn)定性[5]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶基因的調(diào)控.已有的研究表明，sRNA能參與調(diào)控鐵離子代謝[6-7]、碳代謝[8-9]、氨基酸代謝[10-11]、細(xì)菌毒力[12]、酸脅迫[13]、氧化脅迫[14]和蛋白酶活[15]等多個(gè)生理過(guò)程.目前越來(lái)越多的sRNA被發(fā)現(xiàn)，然而研究多集中在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，革蘭氏陽(yáng)性菌研究相對(duì)較少.

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)短小芽孢桿菌SCU11在發(fā)酵培養(yǎng)的各個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)時(shí)期的總RNA進(jìn)行了鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并預(yù)測(cè)了sRNA[16].我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)長(zhǎng)約118 nt的sRNABpsr112，在短小芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)錄活性差異較大，在48 h轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到最高，而胞外蛋白酶酶活通常在48 h最高，這暗示Bpsr112可能在這個(gè)時(shí)期發(fā)揮作用.本研究對(duì)Bpsr112在短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝、脅迫應(yīng)答和蛋白酶活等生理過(guò)程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了描述.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用的菌株和質(zhì)粒詳見(jiàn)表1.

表1 菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids

2.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)：麩皮25 g，黃豆粉20 g，K2HPO44 g，酵母粉3 g，CaCO33 g，NaH2PO40.4 g，pH =8.3.

M9基本培養(yǎng)基(1L)：Na2HPO4·12H2O 17.096 g，KH2PO43 g，NH4Cl 1 g，NaCl 0.5 g，20%葡萄糖 10 mL，2M MgSO41 mL，0.1M CaCl21 mL.

MM培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10 g，硫酸銨2 g，K2HPO414 g，KH2PO46 g，檸檬酸鈉 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 5g，酵母粉 2.5 g.

群集運(yùn)動(dòng)(Swarming)培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.5%(m/v)葡萄糖、0.6%(m/v)瓊脂粉.

2.1.3 主要工具酶和試劑 DIG-Northern Starter kit購(gòu)自Roche公司；PrimeStar Max、SYBR II以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa (大連) 公司；常規(guī)rTaq酶和多片段克隆連接試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas (Thermo) 公司；質(zhì)粒提取、膠回收和純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；TRIzol Reagent 購(gòu)自 Life Technologies 公司；福林酚購(gòu)自科倫公司；山梨醇、甘露醇、甜菜堿購(gòu)自生工生物工程上海 (股份) 有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

2.2 方 法

2.2.1 引物設(shè)計(jì) 采用Primer 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，表2列出了本研究所用的主要引物信息.

表2 本研究使用的引物Tab.2 Primers used in this study

2.2.2 生物信息學(xué)分析Bpsr112的轉(zhuǎn)錄活性和靶基因 利用生物信息學(xué)方法，將短小芽孢桿菌SCU11的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到短小芽孢桿菌BA06基因組，生成bam文件，通過(guò)IGV可視化Bpsr112的轉(zhuǎn)錄活性，獲得Bpsr112表達(dá)活性堆積圖.利用TargetRNA2和CopraRNA軟件預(yù)測(cè)靶基因.

2.2.3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Northern雜交 將過(guò)夜活化的菌株接種到30 mL LB中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h，然后離心收集菌體，加入15 mg/mL 的溶菌酶重懸，37℃，溫浴10 min，最后利用TRIzol提取樣品總RNA.利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除gDNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ，用于qRT-PCR 分析.利用DIG-Northern Starter kit試劑盒進(jìn)行Northern雜交，先用T7-112-F/R引物擴(kuò)增出融合T7啟動(dòng)子的Bpsr112 片段，然后體外轉(zhuǎn)錄，獲得帶標(biāo)記的反義鏈RNA探針(用于雜交和Maker)，總RNA電泳后與RNA探針進(jìn)行Northern雜交，成像觀察.

2.2.4 短小芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化 短小芽孢桿菌SCU11的電轉(zhuǎn)化參照王超等人[17]建立的高滲透壓電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行，只是將電壓調(diào)整至2 200 V，其余條件和步驟與文獻(xiàn)方法一致．

2.2.5Bpsr112基因敲除載體的構(gòu)建 以溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pUCETs為骨架載體，以抗性基因kan替代Bpsr112目的基因,構(gòu)建敲除載體pUCETs-△112，載體的同源臂構(gòu)建策略如圖1所示.

圖1 敲除載體pUCETs-△112的同源臂構(gòu)建策略Fig.1 Constructionstrategy of homologous arms in knockout vector pUCETs-△112

2.2.6Bpsr112基因敲除菌株的篩選 通過(guò)高滲透壓電轉(zhuǎn)化法，將敲除載體pUCETs-△112轉(zhuǎn)化至短小芽孢桿菌SCU11.挑單菌落至5 mL含5 μg/mL紅霉素和10 μg/mL卡那霉素的LB中，30 ℃振蕩培養(yǎng)36 h.再按1%比例接到30 mL無(wú)抗LB中，42 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，連續(xù)傳3代.菌液稀釋后涂布于含4 μg/mL卡那霉素的LB平板，用112screen-F/kan-yz-R引物篩選單交換整合子.挑單交換菌落于5 mL無(wú)抗LB中，42 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，連續(xù)傳2代，菌液稀釋后涂布于含4 μg/mL卡那霉素的LB平板，然后用112screen-F/R引物篩選Bpsr112基因敲除菌株.

2.2.7Bpsr112基因表達(dá)載體的構(gòu)建 用質(zhì)粒pSU03m作為骨架載體，以SCU11 的gDNA為模板，以GBD-112-F/R為引物，擴(kuò)增Bpsr112基因和其上下游啟動(dòng)子、終止子的序列，通過(guò)酶切連接插入pSU03m載體，篩選后得到用于過(guò)表達(dá)的表達(dá)載體pSU03m-112.

2.2.8 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將過(guò)夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0，然后按1%比例轉(zhuǎn)接到30 mL M9液體培養(yǎng)基中，再在37 ℃，200 r/min培養(yǎng)，在合適的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)量OD600nm時(shí)的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線.鹽脅迫實(shí)驗(yàn)在含有0.8 mol/L NaCl的MM培養(yǎng)基中進(jìn)行，然后測(cè)生長(zhǎng)曲線.

2.2.9 運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn) 將過(guò)夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0,吸取1 μL實(shí)驗(yàn)菌液和對(duì)照菌液，點(diǎn)在同一個(gè)Swarming平板上，然后正置于37 ℃培養(yǎng)箱，12 h，拍照觀察，每組3個(gè)重復(fù).

2.2.10 發(fā)酵培養(yǎng)及蛋白酶活測(cè)定 將過(guò)夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0，然后按照4%的比例接種至25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株三個(gè)重復(fù)，34 ℃，200 r/min培養(yǎng)，分別在48 h、60 h、72 h和84 h收集發(fā)酵液，13 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清測(cè)定蛋白酶活，蛋白酶活的測(cè)定按照蛋白酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527-2009[18]進(jìn)行.

3 結(jié) 果

3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示Bpsr112是一個(gè)差異表達(dá)的sRNA

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)短小芽孢桿菌SCU11在各個(gè)發(fā)酵時(shí)期的總RNA進(jìn)行了鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.本研究首先對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Bpsr112在不同時(shí)間點(diǎn)的RPKM值以及Bpsr112及其鄰近染色體區(qū)域的reads覆蓋情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示(圖2A)，Bpsr112在不同時(shí)間點(diǎn)差異轉(zhuǎn)錄，在36 h之前幾乎沒(méi)有表達(dá)，但在48 h迅速達(dá)到峰值，然后下降，初步推測(cè)Bpsr112發(fā)揮功能是在48 h，而前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胞外蛋白酶酶活通常是在48 h達(dá)到最高.我們進(jìn)一步分析了48 h轉(zhuǎn)錄組樣品中Bpsr112和其鄰近基因位置的reads覆蓋情況，結(jié)果顯示(圖2B)Bpsr112的轉(zhuǎn)錄方向和染色體上的下游基因RI02_RS06200(編碼假設(shè)蛋白)相反，與上游基因RI02_RS06195(ispA，編碼絲氨酸蛋白酶)轉(zhuǎn)錄方向相同，并且與ispA基因啟動(dòng)子部分重疊.進(jìn)一步比較6 h，12 h和48 h的reads堆積圖，結(jié)果顯示(圖2C)Bpsr112所在區(qū)域在6 h和12 h均無(wú)reads覆蓋，但上游基因RI02_RS06195卻一直在表達(dá)，因此推測(cè)Bpsr112是一個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的sRNA，不屬于上游基因的5’UTR區(qū)域.

圖2 轉(zhuǎn)錄組分析Bpsr112的表達(dá)水平(A)Bpsr112在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平的RPKM值；(B)48 h樣品中Bpsr112和其鄰近染色體區(qū)域的reads覆蓋情況；橫坐標(biāo)表示DNA長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)為reads的覆蓋數(shù)目，紅色表示染色體正義鏈的reads覆蓋度，藍(lán)色表示反義鏈的reads覆蓋度，綠色箭頭表示Bpsr112基因及其方向，黑色箭頭表示鄰近基因及其方向；(C)2 h、6 h、12 h、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)Bpsr112和其上游基因RI02_RS06195在染色體上的reads覆蓋情況.Fig.2 Transcriptome analysis of Bpsr112 expression levels(A)RPKM value ofBpsr112 at different time points;(B)the reads coverage of Bpsr112 and its adjacent chromosomal regions in 48h; the abscissa represents the length of DNA，the ordinate represents the number of reads coverage，the red region represents the reads coverage of sense chain，the blue region represents the reads coverage of antisense chain，the green arrow represents the Bpsr112 gene and its direction，the black arrow represents the adjacent gene and its direction;(C) the reads coverage of Bpsr112 and its upstream gene RI02_RS06195 at 2 h,6 h，12 h and 48 h.

3.2 Bpsr112基因序列保守性分析

通過(guò)NCBI比對(duì)分析Bpsr112基因序列，發(fā)現(xiàn)Bpsr112基因在隨機(jī)挑選的19個(gè)短小芽孢桿菌株(B．pumilus)中高度保守，在親緣關(guān)系很近的B.cellulasensis、B.aerophilus、B.safensis、B.sp. WP8、B.altitudinis等菌株中都存在同源序列.用進(jìn)化樹(shù)分析Bpsr112序列保守性，如圖3所示，在紅色方框的六個(gè)菌株中，Bpsr112序列的一致性達(dá)到100%，具有高度的結(jié)構(gòu)和序列保守性.但是另一方面，在模式菌株枯草芽孢桿菌168中卻不存在Bpsr112，這或許和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近以及sRNA的物種特異性有關(guān).

圖3 Bpsr112序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Evolutionary tree of Bpsr112 sequence

圖4 Northern雜交鑒定sRNA Bpsr112總RNA上樣量為10 μg，M為帶標(biāo)記的RNA探針，左邊顯示探針長(zhǎng)度.Fig.4 Northern blot ofsRNA Bpsr112The total RNA sample loading volume is 10 μg，M is labeled RNA probe，and the length of probe is shown on the left.

3.3 Northern雜交鑒定Bpsr112

Northern雜交是驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn).因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示Bpsr112在48h表達(dá)水平最高，因此將SCU11發(fā)酵到48 h的總RNA進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果如圖4所示，Bpsr112產(chǎn)生一條雜交帶，而且大小和探針一致，說(shuō)明和轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)的118 nt基本一致，而且證明它是獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的sRNA.

3.4 Bpsr112的靶基因預(yù)測(cè)

由基因間隔區(qū)編碼的sRNA主要通過(guò)不完全的堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合，影響靶mRNA的翻譯或穩(wěn)定性.了解sRNA結(jié)合的靶基因，對(duì)于深入研究sRNA功能和后續(xù)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)作用.因此，采用不同軟件對(duì)Bpsr112的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè).利用TargetRNA2軟件預(yù)測(cè)出30個(gè)靶基因，利用CopraRNA軟件預(yù)測(cè)出的200個(gè)靶基因，表3，表4分別展示前15個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因，功能涉及氨基酸代謝、細(xì)胞壁合成、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性等多個(gè)生理代謝.其中，TargetRNA2預(yù)測(cè)的靶基因fliM與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)，glmS參與細(xì)胞壁的形成.CopraRNA預(yù)測(cè)出蛋白酶基因aprE，而AprE是短小芽孢桿菌胞外蛋白酶活的主要貢獻(xiàn)者，因此Bpsr112具有深入研究?jī)r(jià)值.但是，兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)的靶基因幾乎沒(méi)有重合.

表3 TargetRNA2預(yù)測(cè)Bpsr112靶基因Tab.3 Bpsr112 targets predicted by TargetRNA2

表4 CopraRNA 預(yù)測(cè)Bpsr112靶基因Tab.4 Bpsr112 targets predicted by CopraRNA

3.5 Bpsr112敲除菌株及過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建

為了研究Bpsr112功能，利用同源重組的方法構(gòu)建敲除菌株.先通過(guò)PCR擴(kuò)增出Bpsr112的上下游同源臂flank A和flank B，以及卡那霉素抗性基因Kan，通過(guò)重疊PCR將三個(gè)片段連接起來(lái)得到融合片段flank A-kan-flank B，再將它插入雙酶切后的載體pUCETs，得到敲除載體pUCETs-Δ112.

通過(guò)高滲透壓電轉(zhuǎn)化法，將敲除載體pUCETs-Δ112轉(zhuǎn)化至短小芽孢桿菌SCU11菌株，經(jīng)過(guò)雙交換和質(zhì)粒丟失后，通過(guò)PCR篩選得到Bpsr112基因敲除菌株，通過(guò)PCR及測(cè)序驗(yàn)證，表明Kan基因成功替換Bpsr112，敲除菌株命名為SCU11(Δ112).

將染色體上的Bpsr112完整基因擴(kuò)增下來(lái)，插入到載體pSU03m上，得到pSU03m-112表達(dá)載體.然后通過(guò)高滲透壓電轉(zhuǎn)化法，將pSU03m-112表達(dá)載體和pSU03m空載體轉(zhuǎn)化SCU11，通過(guò)PCR篩選，功得到Bpsr112過(guò)表達(dá)菌株及其對(duì)照菌株，分別命名為SCU11/pSU03m-112和SCU11/pSU03m.

3.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

許多sRNA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和脅迫應(yīng)答具有調(diào)控作用，而B(niǎo)psr112預(yù)測(cè)的靶基因涉及到細(xì)胞壁/膜/包膜合成，Bpsr112是否可能對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和脅迫產(chǎn)生影響？將SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m和SCU11/pSU03m-112共4種菌株過(guò)夜活化，然后接到M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取樣，測(cè)量吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖5(A)所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯的差異，表明Bpsr112不影響生長(zhǎng).

圖5 生長(zhǎng)曲線和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)(A)4種菌株在M9基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；(B)4種菌株在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)曲線.Fig.5 Growth curve and salt stress experiment(A) Growth curves of 4 strains in M9 basic medium; (B) growth curves of 4 strains under salt stress.

將4種菌株接到含有0.8 mol/L NaCl的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h取樣，測(cè)量吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線.結(jié)果如圖5(B)所示，4種菌株的生長(zhǎng)曲線幾乎重合，表明Bpsr112不參與鹽脅迫的調(diào)節(jié).

3.7 運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)

Bpsr112預(yù)測(cè)的靶基因中fliM編碼鞭毛運(yùn)動(dòng)開(kāi)關(guān)蛋白，表明Bpsr112可能與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)有關(guān).利用Swarming運(yùn)動(dòng)平板研究Bpsr112對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的影響.將SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m和SCU11/pSU03m-112共4種菌株過(guò)夜活化，稀釋OD值到1.0，分別取1 μL菌液，點(diǎn)在Swarming運(yùn)動(dòng)平板上.培養(yǎng)12 h，觀察拍照.結(jié)果如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異不明顯，表明Bpsr112可能不參與短小芽孢桿菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控.

圖6 Bpsr112對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的影響Fig.6 Effects of Bpsr112 on mobility of strains

3.8 Bpsr112對(duì)胞外蛋白酶酶活的影響

Bpsr112的候選靶基因還包括堿性蛋白酶基因aprE.將4種菌株過(guò)夜活化，然后接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于蛋白酶主要在發(fā)酵后期產(chǎn)生，因此分別在48 h、60 h、72 h和84 h收集上清液，測(cè)定蛋白酶活.結(jié)果如圖7(A)所示，在48 h時(shí)，4種菌株酶活差異不明顯；在60 h和72 h時(shí)，敲除后的菌株酶活顯著降低(P<0.01)，過(guò)表達(dá)后酶活顯著提高(P<0.01)，其中60 h時(shí)，過(guò)表達(dá)菌株平均酶活達(dá)到4702 U/mL，比對(duì)照菌株提高了153%；在84 h時(shí)，敲除后酶活差異不明顯，但是過(guò)表達(dá)后酶活顯著提高(P<0.01).

將60 h和72 h的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖7(B)所示，與對(duì)照相比，AprE蛋白含量在敲除菌株中降低，在過(guò)表達(dá)菌株中提高，這與蛋白酶活測(cè)定的結(jié)果一致.結(jié)果表明Bpsr112對(duì)短小芽孢桿菌胞外蛋白酶酶活具有正調(diào)控作用.

圖7 Bpsr112對(duì)胞外蛋白酶酶活的影響(A)4種菌株發(fā)酵48 h、60 h、72 h、84 h時(shí)的蛋白酶酶活；(B)4種菌株發(fā)酵 60 h、72 h時(shí)的上清液的SDS-PAGE電泳. M1：AprE蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，略小于35 kDa；M2：蛋白Maker；數(shù)字1、2、3、4分別表示SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m 和SCU11/pSU03m-112四種菌株.Fig.7 Effects of Bpsr112 on extracellular protease activity(A) Protease activities of 4 strains at 48 h，60 h，72 h and 84 h; (B) SDS-PAGE electrophoresis of supernatant of 4 strains at 60 h and 72 h. M1:AprE protein standard，slightly less than 35 kDa; M2: protein maker; numbers 1，2，3，4 represent SCU11，SCU11 (Δ112)，SCU11/psu03m and SCU11/psu03m-112，respectively.

4 討 論

短小芽孢桿菌SCU11能夠通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，高效產(chǎn)生胞外蛋白酶.實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)對(duì)各個(gè)發(fā)酵關(guān)鍵時(shí)期的菌液進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)長(zhǎng)118 nt的新sRNABpsr112，并且通過(guò)Northern雜交證明Bpsr112能夠獨(dú)立轉(zhuǎn)錄.為了探究Bpsr112的功能，根據(jù)預(yù)測(cè)的靶基因的功能，我們對(duì)野生型、Bpsr112敲除及過(guò)表達(dá)菌株進(jìn)行了鹽脅迫和運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)比較，結(jié)果表明Bpsr112并無(wú)明顯的調(diào)控作用.一方面的原因可能是生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的可靠性比較低，存在假陽(yáng)性.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因主要是根據(jù)sRNA的保守性、sRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及sRNA-mRNA相互作用的自由能來(lái)預(yù)測(cè)靶基因.但是保守的序列并不容易獲??；高結(jié)合能也并不意味著一定能和mRNA有效結(jié)合；sRNA與靶基因的作用還可能會(huì)受到蛋白質(zhì)的影響，這又會(huì)嚴(yán)重地影響軟件預(yù)測(cè)[19].另一方面可能是因?yàn)檎{(diào)控細(xì)菌鹽脅迫和運(yùn)動(dòng)性的網(wǎng)絡(luò)比較復(fù)雜，Bpsr112突變的影響可能被其他調(diào)節(jié)途徑恢復(fù)了，因此未表現(xiàn)出明顯的差異.

CopraRNA軟件預(yù)測(cè)出蛋白酶基因aprE是Bpsr112潛在的靶基因，而AprE是短小芽孢桿菌胞外蛋白酶活的主要貢獻(xiàn)者.通過(guò)Bpsr112敲除菌株和過(guò)表達(dá)菌株的蛋白酶活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Bpsr112對(duì)胞外蛋白酶活具有正調(diào)控作用.推測(cè)Bpsr112能夠促進(jìn)aprE基因的表達(dá)，從而提高胞外蛋白酶酶活，但這種促進(jìn)作用是直接的還是間接的，則需要更多的實(shí)驗(yàn)鑒定.一般來(lái)說(shuō)，sRNA直接激活靶基因的機(jī)制可能是由于靶mRNA的5’UTR區(qū)域存在二級(jí)結(jié)構(gòu)封閉了RBS位點(diǎn)，核糖體無(wú)法結(jié)合上去.一些sRNA可以與靶mRNA結(jié)合，改變?cè)摱?jí)結(jié)構(gòu)，暴露出RBS位點(diǎn)，從而激活翻譯.也可能是由于sRNA的結(jié)合封閉了RNA酶的切割位點(diǎn)，增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)翻譯[20].通過(guò)Mfold軟件預(yù)測(cè)aprEmRNA(5’UTR和起始密碼子后部分區(qū)域)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖8(A)所示，aprEmRNA的RBS位點(diǎn)區(qū)域(通常RBS位于起始密碼子前8～13個(gè)核苷酸)形成了二級(jí)結(jié)構(gòu)，封閉了RBS位點(diǎn).CopraRNA軟件預(yù)測(cè)Bpsr112可與aprEmRNA形成堿基配對(duì)，如圖8(B)所示.當(dāng)aprEmRNA(紅色區(qū)域部分)與Bpsr112結(jié)合后，原先的二級(jí)結(jié)構(gòu)被改變，RBS位點(diǎn)暴露出來(lái)，從而可能激活aprE基因翻譯.有研究表明sRNA可直接或間接地調(diào)控芽孢桿菌蛋白酶基因表達(dá)，例如，在地衣芽孢桿菌中，由apr基因反義鏈編碼的sRNA AprAs可以通過(guò)堿基配對(duì)，抑制枯草桿菌蛋白酶(Apr)的表達(dá)[15].在枯草芽孢桿菌中，sRNA RnaC/S1022可以通過(guò)調(diào)節(jié)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AbrB來(lái)負(fù)調(diào)控aprE基因的表達(dá)[21].Bpsr112與aprE之間的相互作用需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，比如利用報(bào)告基因探究Bpsr112與aprEmRNA的直接相互作用.這對(duì)系統(tǒng)揭示Bpsr112的功能至關(guān)重要，對(duì)進(jìn)一步提高短小芽孢桿菌的酶活也有重要意義.

圖8 Bpsr112與aprE mRNA相互作用分析(A)aprE mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，紅色區(qū)域?yàn)轭A(yù)測(cè)的結(jié)合位置，綠色區(qū)域?yàn)橥茰y(cè)的 RBS位點(diǎn)，紫色區(qū)域?yàn)槠鹗济艽a子；(B)預(yù)測(cè)Bpsr112與aprE mRNA的堿基配對(duì)，紅色區(qū)域?qū)?yīng)于(A)的紅色區(qū)域，藍(lán)色區(qū)域?yàn)閟RNA的主要結(jié)合區(qū)域.Fig.8 Interaction betweenBpsr112 and aprE mRNA(A) Secondary structure ofaprE mRNA. The red region is the predicted binding site，the green region is the predicted RBS site，and the purple region is the initial codon. (B) Predicted base pairing of Bpsr112 and aprE mRNA. The red region corresponds to the red region of (A)，and the blue region is the main binding region of sRNA.

5 結(jié) 論

本研究通過(guò)分析短小芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新sRNABpsr112，并通過(guò)Northern雜交進(jìn)行鑒定.通過(guò)敲除菌株和過(guò)表達(dá)菌株，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線、鹽脅迫和蛋白酶活等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Bpsr112對(duì)蛋白酶活具有正調(diào)控.本研究首次描述了短小芽孢桿菌中具體的sRNA功能，對(duì)于進(jìn)一步提高短小芽孢桿菌的酶活具有重要意義.