魚類逆境情況下MicroRNA表達(dá)研究進(jìn)展

陳一竹，楊長幸，馬文文，王 月，馮夢霞，董文廣，汪 曦，張 曼，董 靜，高云霓，顧錢洪，周傳江

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

魚類因其生活環(huán)境的多變性，在其生活史中經(jīng)常受到各種環(huán)境脅迫，因環(huán)境條件改變產(chǎn)生的不利變化都會使動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。疾病、有機(jī)體損傷、低氧、重金屬和環(huán)境污染等均會打破魚體原有的平衡，影響魚類生長甚至生存。而脊椎動物進(jìn)化出了能夠依靠轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子進(jìn)行自我保護(hù)的復(fù)雜免疫反應(yīng)[1]，這些免疫反應(yīng)的激活信號通路主要通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活[2]，因此在逆境中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的變化就具有重要的參考意義。魚類因正常生活環(huán)境被改變而受到不利環(huán)境因素刺激后，會進(jìn)行自我保護(hù)，通過調(diào)控自身轉(zhuǎn)錄水平來適應(yīng)環(huán)境的改變。研究表明，MicroRNAs在哺乳動物、植物、低等脊椎動物等生物體中廣泛存在，參與生物體細(xì)胞分化、生長發(fā)育、疾病發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)、抗低氧等生命活動過程，并扮演著重要角色[3-6]，筆者主要總結(jié)魚類逆境適應(yīng)中相關(guān)MicroRNA研究進(jìn)展，以期為探究魚類適應(yīng)逆境機(jī)制提供參考。

1 MicroRNA的發(fā)現(xiàn)歷程

MicroRNA(miRNAs)是由Victor等于1993年最早發(fā)現(xiàn)的，其通過線蟲胚胎發(fā)育時間控制缺陷性遺傳篩選試驗，鑒定出一個通過抑制lin-14蛋白表達(dá)來控制線蟲發(fā)育時間的小分子RNA——lin-4(miRNAs家族成員之一)[7-9]，但在隨后的一段時期內(nèi)并沒有引起人們的重視。直到后來又一個miRNA——let-7被發(fā)現(xiàn)，研究者們才開始深入了解、研究該家族及其功能作用機(jī)制[10-12]。研究者通過試驗與生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們在進(jìn)化上處于高度保守狀態(tài)[13-14]，這預(yù)示著這個小分子家族可能具有十分廣泛和重要的作用。自let-7被發(fā)現(xiàn)之后，研究者們發(fā)現(xiàn)并證實了miRNA廣泛存在于多種動植物中，目前在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、鯉魚(Cyprinuscarpio) 、斑馬魚(Daniorerio)、虹鱒(Oncorhynchusmyliss)以及人(Homosapiens)中均有發(fā)現(xiàn)并鑒定出多個miRNA[15-19]。

2 MicroRNA命名及其特征

根據(jù)MicroRNA注冊中心 (http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/)的注冊要求，當(dāng)對一個全新的miRNA進(jìn)行注冊登記時，會基于miRNA的序列相似性給出數(shù)字標(biāo)識符。例如，在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中鑒定出了miR-318，則之后鑒定出不同于之前鑒定的miRNA會給予連續(xù)標(biāo)號的名稱，如miR-319。在不同生物體中的同源序列可命名為相同的名稱。

基于被切除的約22個核苷酸序列的相似性，成熟序列相同的將會被命名為同一個名稱，例如果蠅中的miR-6-1和miR-6-2(從它們分開的基因位點(diǎn)給出數(shù)值后綴)[20]。如果有1個或2個堿基變化的序列，分配名稱的后綴如miR-181a和miR-181b[13]，有更多堿基差異的同源序列，通過分析初級轉(zhuǎn)錄物發(fā)夾部分序列相似性或與作者討論確定名稱。

從一個miRNA的發(fā)夾前體中切除得到的2個miRNA[來自于不同的“臂”(arm)]在表達(dá)過程中不占主導(dǎo)地位的加注“*”，例如黑腹果蠅中的miR-56和miR-56*[21]。在未確定哪個在表達(dá)過程中占主導(dǎo)地位之前，目前主張以加后綴“-3p”表示3′(arm)，“-5p”表示5′(arm)的形式表示，例如miR-140-3p。但以前的報道中有用miR-142-s和miR-142-as表示5′(arm)和3′(arm)[22]。

由于最初發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA分子在發(fā)育時序調(diào)控上具有相似的作用而被稱為小時序RNA(stRNA)。此后，越來越多新的非編碼小RNA分子被發(fā)現(xiàn)，與lin-4和let-7來源相同、長度相似(均為21～25 nt)，且內(nèi)源性表達(dá)具有進(jìn)化上的高度保守性。但這些新發(fā)現(xiàn)的小RNA分子并不具有l(wèi)in-4和let-7所具有的時序表達(dá)性，而傾向于在特異性細(xì)胞或組織中表達(dá)[23]。因此，研究者們認(rèn)為此類分子并不僅僅只是時序性調(diào)控生物發(fā)育，應(yīng)具有更為廣泛的功能。于是學(xué)者們將之稱為miRNA，特指那些具有以下特征的小分子RNA：來自于具有莖—環(huán)結(jié)構(gòu)前體的一條手臂上；成熟的miRNA 5′端有一個磷酸基團(tuán)，3′端為羥基；內(nèi)源性表達(dá)長度為21～25 nt的小RNA分子；進(jìn)化上具有保守性(圖1)。

圖1 計算機(jī)預(yù)測的編碼MicroRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)

3 MicroRNA的調(diào)控、功能及靶基因

miRNA是一類非編碼的內(nèi)源小分子RNA，長度約為21～25 nt，作為非編碼RNA中的一員，它在魚類生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用[19,25-27]。它可以通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式調(diào)控靶基因[6,28]，因此，尋找與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的重要miRNA并探索其如何介導(dǎo)魚類逆境調(diào)控機(jī)制顯得十分迫切。

第一個關(guān)于硬骨魚miRNA的研究是對斑馬魚miR-430功能的探討。試驗中通過注射miR-430用于拯救大腦MZdicer(maternal-zygotic dicer)缺陷突變體，推測miR-430在斑馬魚形態(tài)形成中扮演著關(guān)鍵的角色[29]。目前，研究者們普遍認(rèn)為miRNA通過與靶基因(通常認(rèn)為其目標(biāo)mRNA分子存在3′端非編碼區(qū)域)互補(bǔ)匹配，使該mRNA分子的翻譯受到抑制或者直接降解該mRNA；當(dāng)互補(bǔ)程度較低時便會使mRNA的翻譯抑制；高度互補(bǔ)時會導(dǎo)致靶mRNA的降解[6,30]。隨著miRNA被大量發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們對miRNA功能的研究也越來越感興趣。一些使用反向遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的miRNA，通過基因突變或在miRNA的靶位點(diǎn)上引入突變來抑制miRNA的作用，進(jìn)而觀察機(jī)體表型變化來探究其功能線索[31]。各方面的信息暗示著miRNA的功能作用并不僅僅限制于單個方面，越來越多的報道表明miRNA參與細(xì)胞生理學(xué)各個方面，有著多方面功能潛力[32]。此外，同一個靶基因可以由多個miRNA共同調(diào)控，同樣，同一個miRNA也存在著多個不同的靶基因，因此某些基因功能的表達(dá)是多個miRNA共同作用的結(jié)果(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在生物體細(xì)胞增殖、胚胎形成、生長發(fā)育、脂肪代謝及疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮著十分重要作用[13,33-36]，但對其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。

圖2 miRNA調(diào)控靶基因作用示意

雖然虹鱒、斑馬魚和鯉魚等少數(shù)魚類部分miRNA已經(jīng)被鑒定[16-18]，但目前關(guān)于魚類miRNA的研究仍相當(dāng)匱乏。有關(guān)魚類miRNA方面的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)，根據(jù)miRNA收錄網(wǎng)站(http:∥www.mirbase.org/index.shtml)的數(shù)據(jù)顯示，已經(jīng)收錄的miRNA數(shù)量多達(dá)38 589條(2018年3月18日最新更新)，成熟的miRNA超過30 000個，涵蓋271個物種，但僅僅只有很少的魚類miRNA序列被收錄，各個研究者根據(jù)研究目的和研究重點(diǎn)不同，內(nèi)容有交叉的研究更少。

4 魚類逆境下MicroRNA研究進(jìn)展

魚類生活在不同的環(huán)境中，其生命活動面臨多重因素的影響，比如溫度變化、低氧、機(jī)體損傷、細(xì)菌感染、水體中內(nèi)源性藻類異常增殖、多種來源的外來污染物，如重金屬和農(nóng)藥的脅迫等，機(jī)體調(diào)動相關(guān)的miRNAs參與這些因素調(diào)控過程。

4.1 溫度對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

溫度變化能影響miRNA的mRNA作用于靶細(xì)胞，從而適當(dāng)改變信號通路影響mRNA的翻譯去幫助機(jī)體適應(yīng)溫度變化[38]。Beauchemin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在熱誘導(dǎo)下，其體內(nèi)miR-101a在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)有顯著的增加，并發(fā)現(xiàn)hsp70(熱脅迫下，有利于機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的重要蛋白)誘導(dǎo)能改變miR-101a轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，重要的是長期每天熱處理未顯著影響斑馬魚的生存。Biggar等[39]通過冷凍處理來檢測錦龜(Chrysemyspicta)的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制，檢測到在低溫脅迫下有miRNAs有特殊的表達(dá)變化，經(jīng)20 h的冷凍處理，在其肝組織檢測到cpm-miR-16在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量上調(diào)，而cpm-miR-34a和cpm-miR-133轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)顯著減少，且發(fā)現(xiàn)cpm-miR-16和cpm-miR-21能有效地提高新陳代謝，并在冷凍室適應(yīng)中具有獨(dú)特的功能。這都揭示出miRNA在魚類適應(yīng)溫度脅迫中可能起著重要的作用。

4.2 低氧對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

缺氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞急性和慢性缺血導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[40-41]。據(jù)報道，一些缺氧相關(guān)的蛋白會將氧信息變化傳遞給下游的信號效應(yīng)器，這些蛋白質(zhì)可以幫助魚類感知氧濃度大小，有利于魚類在一定范圍內(nèi)適應(yīng)環(huán)境中氧濃度，超出濃度范圍會導(dǎo)致細(xì)胞編程性死亡[42-43]。據(jù)研究表明，miRNA在細(xì)胞凋亡中扮演著關(guān)鍵角色(如miR-20a，miR-21，miR-146a，miR-222等均為細(xì)胞中重要的抗凋亡miRNAs)[44-47]。Xu等[48]通過低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的試驗發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-21、miR-146a、miR-20a等在抑制心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，且miRNA之間存在協(xié)同作用，在低氧誘導(dǎo)過程中，單獨(dú)接種miR-20a和miR-21 (40 nmol/L) 的細(xì)胞活力分別恢復(fù)8.2%和7.5%，當(dāng)同時接種miR-20a和miR-21 (20 nmol/L) 時能使細(xì)胞活力恢復(fù)21.6%。通過接種miR-1、miR-21、miR-146a，在不同組內(nèi)分別抑制其活性，miR-1和miR-21共同阻止了低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。在miR-1和miR-21表達(dá)組中，p53的mRNA水平顯著降低(p53蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞缺血性凋亡，因此，抑制p53蛋白凋亡信號是一個潛在的策略以防止缺血所致的心肌損傷)[49-50]。Nallamshetty等[51]在青鳉(Oryziaslatipes)的低氧脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)總共14個miRNA在轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出明顯變化，其中9個上調(diào)和5個下調(diào)，此外，還發(fā)現(xiàn)mir-204-5p可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，如HIPK1。Camps等[52]通過低氧脅迫癌細(xì)胞16、32、48 h，觀察到hsa-miR-222-5p, hsa-miR-145-3p與 hsa-miR-4521分別出現(xiàn)下調(diào)，并檢測到hsa-miR-145-3p作用于靶基因調(diào)節(jié)缺氧狀態(tài)下線粒體的活動。這些結(jié)果表明，miRNA在機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境中扮演著重要角色。迄今為止，關(guān)于魚類的miRNA在適應(yīng)低氧環(huán)境中功能作用的研究僅有少量報道，因此，探究魚類的miRNA在適應(yīng)低氧環(huán)境中的功能作用研究具有重要的科學(xué)價值。

4.3 機(jī)體損傷對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

某些魚類在成年后依然保留良好的組織器官再生能力[53-54]，如斑馬魚的心肌損傷后(心室切除、低溫?fù)p傷)能完全再生。血統(tǒng)追蹤試驗揭示了心肌細(xì)胞去分化是形成新的心肌細(xì)胞的主要來源，為了應(yīng)對損傷，已有的成熟心肌細(xì)胞進(jìn)行肌動蛋白的分解過程，重新進(jìn)入細(xì)胞周期和增殖[55-57]。在進(jìn)一步受傷的部位由纖維組織局部去分化形成的細(xì)胞替換受傷的心肌細(xì)胞[58]。研究表明，miRNA在心臟細(xì)胞受傷后再生的早期階段扮演著重要的角色。Beauchemin等[25]在心室受傷6 h后的斑馬魚中檢測到miR-101a、miR-19b、miR-29a、miR-214、miR-222、miR-203b和miR-738在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)均有上調(diào)。通過深入研究證實了心肌細(xì)胞的去分化和增殖與miR-101a表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，在心臟細(xì)胞受傷后miR-101a的表達(dá)會立刻下調(diào)來響應(yīng)心肌細(xì)胞受損，在3～6 h后，miR-101a表達(dá)會穩(wěn)步降至最低水平。Yu等[59]的研究結(jié)果顯示，mir-133b在成年斑馬魚的脊髓再生中起著決定性作用，在斑馬魚脊髓損傷再生中，mir-133b通過內(nèi)源性調(diào)控RhoA(是一個軸突生長的抑制劑，以及其他神經(jīng)突相關(guān)的生長分子)，它通過直接與RhoA mRNA相互作用降低RhoA蛋白水平，促使脊椎軸突再生，從而促進(jìn)斑馬魚脊椎損傷的恢復(fù)。

4.4 細(xì)菌感染等疾病對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

目前研究已證實，miRNA參與人類及其他動物的免疫和疾病防御中發(fā)揮重要作用，如Koscianska等[19]研究強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良Ⅰ型(DM1)時發(fā)現(xiàn)miR-206 與miR-148a共同發(fā)揮著重要的作用。而與人類免疫和疾病防御相關(guān)的部分miRNA，在魚體內(nèi)也多有存在，但對其在魚體內(nèi)功能的研究卻少有報道，有待深入研究其功能及作用機(jī)制。

4.5 藻毒素對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

Brzuzan等[66]通過真白鮭(Coregonuslavaretus)的微囊藻脅迫試驗，在檢測其肝臟中miRNA的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-122在肝臟的代謝通路和調(diào)控中起著關(guān)鍵性的作用，miR-122通過抑制靶基因或調(diào)控細(xì)胞基因的表型來調(diào)控肝臟的功能。在其肝臟中miR-16a也出現(xiàn)顯著的上調(diào)，而miR-16a在魚類免疫中起著至關(guān)重要的作用[16]。Lakomiak等[67]通過在白鮭魚體內(nèi)注射微囊藻毒素試驗發(fā)現(xiàn)，接觸MC-LR會改變miR-34a在真白鮭肝臟中的表達(dá)模式，使肝臟中的miR-34a表達(dá)上調(diào)。在微囊藻毒性試驗中，通過沉默miR-34a和bcl-2的表達(dá)會引起蛋白質(zhì)的磷酸化退化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Li等[17]通過使用不同質(zhì)量濃度微囊藻毒素脅迫斑馬魚發(fā)現(xiàn)，斑馬魚肝臟中多個miRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)受到影響。通過qRT-PCR檢測用0、50、200 mg/L和800 mg/L微囊藻毒素脅迫處理24 h后斑馬魚肝臟miRNA表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，dre-miR-27b和dre-miR-21表達(dá)上調(diào)，dre-miR-122和dre-miR-148a在所有組中均表達(dá)上調(diào)。

4.6 重金屬對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

重金屬污染物威脅著魚類的生長發(fā)育、繁殖等，并可對其生理功能、機(jī)體組織結(jié)構(gòu)和遺傳特征等造成重大影響。銅、鎘等是常見的重金屬污染物。Wang等[68]在使斑馬魚暴露于氯化銅污染的試驗中發(fā)現(xiàn)，在不同質(zhì)量濃度的氯化銅溶液中miRNA的表達(dá)水平有明顯差異。通過設(shè)置6、16 ng/mL Cu2+和40 ng/mL Cu2+的梯度試驗，用1齡相同大小的斑馬魚，在合適的密閉環(huán)境中暴露于銅污染下24 h，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子質(zhì)量濃度的增加miRNA的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)發(fā)生了變化。如miR-183在16 ng/mL、40 ng/mL Cu2+組中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)(16 ng/mL、40 ng/mL Cu2+分別下調(diào)了52%和45%)。而miR-183在內(nèi)耳感覺神經(jīng)中起著重要的作用，敲除miR-183會導(dǎo)致內(nèi)耳感覺神經(jīng)受損[69]。在3個試驗組中，分別有1個、7個、23個miRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，1個、3個、5個miRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，尤其是通過上調(diào)miR-203a、miR-199、miR-16a、miR-16c和miR-25發(fā)現(xiàn)可能會造成斑馬魚mRNA水平鈣信號減少。

4.7 農(nóng)藥及有機(jī)物對魚類MicroRNA表達(dá)的影響

從以上研究可知，在這些不利因子影響下，魚類適應(yīng)外界不利環(huán)境過程中，miRNA發(fā)揮著重要的作用。

5 展 望

逆境引發(fā)魚類各種適應(yīng)性反應(yīng)，旨在縮小影響或適應(yīng)逆境造成的破壞并恢復(fù)正常的生理機(jī)能，根據(jù)其刺激的類型及其持續(xù)時間不同，反應(yīng)的種類也不盡相同。近年來，關(guān)于魚類逆境相關(guān)的研究逐漸增多，然而魚類的抗逆性是外界和自身一系列因素共同作用的結(jié)果，但當(dāng)前的研究大多均通過實驗室模擬逆境條件來實現(xiàn)的，且多在單一逆境條件下進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白基因研究。然而，自然狀態(tài)下的魚類通常受到多種逆境脅迫，存在時間先后性與多重作用疊加。但同一miRNA在不同逆境和不同物種中的調(diào)控研究鮮有報道，而不同miRNA可共同調(diào)控同一個靶基因，同一個miRNA也存在著多個不同靶基因，那么在復(fù)雜的自然條件下，同一miRNA在不同逆境同時作用下其表達(dá)調(diào)控與作用關(guān)系會如何？因此，在今后的研究中應(yīng)當(dāng)探討多基因共同作用的關(guān)系，在調(diào)控基因表達(dá)量和表達(dá)時間等方面進(jìn)行深入研究。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA的表達(dá)受諸多因素的影響。溫度、藻毒素、細(xì)菌、農(nóng)藥、重金屬、低氧等刺激下，各類相關(guān)miRNA的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)會發(fā)生變化，通過轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控和蛋白作用幫助魚類適應(yīng)逆境。miRNA能對多個靶基因的功能及表達(dá)產(chǎn)生影響，其表達(dá)水平的改變可以從本質(zhì)上影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)補(bǔ)充。迄今為止，關(guān)于miRNA和靶基因作用機(jī)制的報道相當(dāng)有限，且涉及到多個miRNA和靶基因相互作用的報道則更少。因此，在未來的研究應(yīng)當(dāng)更加深入地研究miRNA和重要蛋白的表達(dá)機(jī)制和功能及此過程中多個miRNA及靶基因的相互作用關(guān)系。

miRNA在不同的逆境、不同物種中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，也提醒我們其作用機(jī)制的復(fù)雜性。同時伴隨著新的研究技術(shù)手段及方法的陸續(xù)采用，相信關(guān)于魚類及其他動物逆境適應(yīng)研究會取得長足發(fā)展。