甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)代謝及肝毒性研究

蘇美珍，張祎桐，王 浩，呂利群

( 1.上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

甲苯咪唑(MBZ)屬于苯并咪唑類(lèi)藥物，又名甲苯達(dá)唑、二苯酮咪胺酯、安樂(lè)土，其化學(xué)名為(5-苯甲酰基-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯，是一種廣譜性驅(qū)蟲(chóng)藥物，可用于防治蛔蟲(chóng)、絲蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)(Enterobiusvermicularis)、鞭蟲(chóng)(Trichuristrichura)、糞類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)(Strongyloidesstercoralis)等腸道寄生蟲(chóng)的疾病[1-3]。

近年來(lái)，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，也帶來(lái)了魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)感染病，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，逐漸引起人們的重視[4]。甲苯咪唑作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)的治療寄生蟲(chóng)疾病的藥物，其副作用和殘留量較大?？诠嗟募妆竭溥蛑饕じ皆谀c道部位，吸收后分布在血液、腎臟、肝臟等部位，主要分布在肝胰臟[5]?？诜妆竭溥蛞矔?huì)損傷魚(yú)類(lèi)的生理功能。20多年的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服甲苯咪唑會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)[6-8]。需氧生物在氧化還原中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，而活性氧是自由基的重要組成部分，少量的自由基是必需，但是，自由基過(guò)量就會(huì)對(duì)生物機(jī)體造成氧化損傷。生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，體內(nèi)形成了一套完整清理機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基的抗氧化系統(tǒng)[9]。其中超氧化物歧化酶是抗氧化酶系統(tǒng)重要成分之一，是一種能反映機(jī)體清除自由基能力的酶[10]。過(guò)氧化氫酶也是一種抗氧化劑酶，對(duì)于防止產(chǎn)生有害的陰離子，在減輕氧化損傷中起到重要的作用。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是一種氧自由基捕獲劑。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶屬于抗氧化劑酶，都是描述藥物綜合毒理學(xué)效應(yīng)的酶類(lèi)。機(jī)體損傷時(shí)會(huì)破壞抗氧化酶的活性，改變抗氧化酶基因的表達(dá)[11]。堿性磷酸酶在生物體解毒過(guò)程中起重要的作用；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸間氨基轉(zhuǎn)移的一類(lèi)酶。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中，血清中含量很少。但機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶會(huì)從細(xì)胞中逸出到血液，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性就會(huì)增加[12]。堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶與肝功能有關(guān)，易受環(huán)境的影響，即肝細(xì)胞受損時(shí)，就會(huì)觸發(fā)這些酶的活性。

得益于魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究方法的成熟，制定甲苯咪唑在異育銀鯽各組織中的代謝曲線(xiàn)為其休藥期的制定提供了依據(jù)。但是迄今未見(jiàn)甲苯咪唑在異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)體內(nèi)藥物毒性的研究。我國(guó)異育銀鯽的年產(chǎn)量接近2.5×106t，但疾病頻發(fā)，養(yǎng)殖用藥量大且用藥安全風(fēng)險(xiǎn)高，出于合理用藥、安全用藥的需要，筆者比較了甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟的富集水平，研究其最高富集組織中藥物的肝毒性，為甲苯咪唑的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

體表健康的異育銀鯽300尾，體質(zhì)量(90±20) g，購(gòu)于中國(guó)江蘇省烏江縣，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)水族箱，試驗(yàn)水溫(20±2) ℃，正常供氧，試驗(yàn)前24 h停止投喂。

99%甲苯咪唑原粉，0.22 μm有機(jī)系濾頭，1 mL一次性滅菌注射器，草酸鉀，氯化鈉，DEPC水[生工生物工程(上海)股份有限公司]；99.5%甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量 99.5%)(Ehrenstorfer Quality)；甲醇(色譜級(jí))，甲酸(色譜級(jí))，乙腈，水(色譜級(jí)),三氯甲烷(中國(guó)上海國(guó)藥化學(xué)試劑)；CNW 9 mm棕色螺旋口自動(dòng)進(jìn)樣瓶，250 μL尖底玻璃內(nèi)插管，9 mm開(kāi)孔擰蓋(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；過(guò)氧化物歧化酶試劑盒，過(guò)氧化氫酶試劑盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒，堿性磷酸酶試劑盒，谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，總蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRlzol(Invitrogen公司)；PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司)。

UPLC/MS線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀(Waters公司)；漩渦混勻器(上海本昂科學(xué)儀器有限公司)；TDL8M臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀器有限公司)；超純水儀(成都浩純儀器設(shè)備責(zé)任有限公司)；超聲波清洗機(jī)(上海分析超聲儀有限公司)；低溫保藏箱(Haier公司)；組織勻漿儀(Sigma公司)；電子分析天平(上海?？祪x器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(Promege公司)；CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.2 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取甲苯咪唑10 mg，用88%甲酸溶解于100 mL棕色量瓶中，加入色譜級(jí)甲醇到刻度線(xiàn)后充分混勻，配置質(zhì)量濃度為100 μg/mL的甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將配置好的甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋為0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg/mL，然后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3 色譜條件

樣品分析儀為UPLC/MS線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀，色譜柱是Hypersil Gold，規(guī)格為100 mm×2.1 mm，1.9 μm，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30 ℃，離子源ESI，正離子模式，錐孔電壓30 V，掃描方式多離子監(jiān)測(cè)，脫溶劑氣溫150 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，離子對(duì)(定量離子對(duì)和定性離子對(duì))m/z為264～296。洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.4 方法

由300尾健康異育銀鯽中隨機(jī)選取數(shù)尾。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg 甲苯咪唑，先用少許的甲酸溶解，再用蒸餾水定容，配制為4 mg/mL。按照20、10、5 mg/kg的藥量用胃管灌胃給藥。在給藥后1、2、4、6、10、24、48、84 h自魚(yú)尾靜脈取血。在取出的血中立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10，體積比)混勻，然后以4000 r/min離心10 min；同時(shí)迅速取肝胰臟和腎臟樣品。所有樣品放置冰箱-80 ℃冷凍保存。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3尾魚(yú)，3個(gè)平行。

隨機(jī)選取數(shù)尾健康異育銀鯽，分為兩組。第一組對(duì)照組口灌5%甲酸，第二組試驗(yàn)組口灌20 mg/kg甲苯咪唑。分別在給藥后的0、24、48 h取肝臟處理測(cè)定超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶基因的表達(dá)量情況。

甲苯咪唑藥代樣品處理方法參考文獻(xiàn)[13]。將血漿、肝臟、腎臟樣品在室溫下自然解凍，取500 μL血液于2 mL離心管中加入750 μL甲醇，6000 r/min離心5 min，取上清液。重復(fù)2次，合并上清液于1200 r/min離心20 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，濾液待上機(jī)檢測(cè)。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g的肝胰臟和0.2 g的腎臟于15 mL離心管中，分別加入1 mL的甲醇，用組織勻漿機(jī)勻漿，6000 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)2次，合并上清液，分別加入1 mL正己烷，混勻，于12 000 r/min離心10 min，濾液過(guò)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，濾液待上機(jī)檢測(cè)。

魚(yú)體超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶活力測(cè)定：分別取口灌20 mg/kg 甲苯咪唑后0、24、48 h的異育銀鯽肝胰臟于預(yù)冷的0.86%氯化鈉中漂洗，除去血液，濾紙擦干。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g肝胰臟樣品放入2 mL離心管中，加入0.86%氯化鈉，用組織勻漿機(jī)勻漿(加入生理鹽水的體積總量是樣品質(zhì)量的9倍)制作成10%的組織勻漿，之后于2000 r/min離心10 min。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性。

血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定：分別取口灌0、24、48 h后魚(yú)的血漿，立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10，體積比)混勻，于1000 r/min離心5 min，取上清液。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。

肝胰臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)量的測(cè)定：分別取口灌0、24、48 h魚(yú)的肝胰臟，用Trizol法從肝胰臟中分離總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)測(cè)定超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)量的變化。所用的引物由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上查找異育銀鯽的序列合成，引物序列見(jiàn)表2。采用TBgreen酶。Real time PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，共37個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，溫度由65 ℃升至95 ℃，此過(guò)程不斷收集熒光信號(hào)，形成熔解曲線(xiàn)。測(cè)定口灌0、24、48 h異育銀鯽超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶兩種基因表達(dá)量的變化。

表2 試驗(yàn)中所用到的引物

1.5 回收率及精密度

回收率：取空白的血清500 μL加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液，取肝胰臟0.2 g，腎臟0.2 g分別加入少許甲醇進(jìn)行組織勻漿，然后再分別加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液。之后分別稀釋為1.0、0.5、0.1 μg/mL，按照甲苯咪唑樣品預(yù)處理的方法處理，測(cè)定回收率。每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行，取其平均值為實(shí)際測(cè)定質(zhì)量濃度。

回收率/%=Cr/C0×100%

式中，Cr為空白樣品(血液或者肝腎臟)加入了一定量的甲苯咪唑后測(cè)定的試劑質(zhì)量濃度，C0為加入一定量甲苯咪唑已知標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度。

精密度：同一樣品1 d內(nèi)不同時(shí)間測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3 d，之后測(cè)定血液、肝胰臟、腎臟中甲苯咪唑的日內(nèi)和日間平均變異系數(shù)，來(lái)判斷該方法的精密度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

圖表用Excel 2010制作，使用DAS 3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件、Masslynx V 4.1軟件和SPSS軟件分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)為y=57 387.6x+112 015(r2=0.989903)，在1～50 ng/mL內(nèi)，甲苯咪唑的峰面積與其質(zhì)量濃度呈較好的線(xiàn)性關(guān)系(圖1)。

圖1 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

2.2 回收率與精密度

由表3可知，在含有甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品1.0、0.5、0.1 μg/mL的組織樣品中，異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟樣品中的回收率分別為79.91%～83.68%、78.23%～89.46%和87.26%～95.94%；其日內(nèi)變異系數(shù)分別為1.16%～8.22%、0.51%～2.83%和1.81%～13.59%；日間變異系數(shù)為1.04%～2.29%、1.98%～7.32%和1.81%～2.96%。表明此方法處理樣品組織，可以得到較高的回收率，重復(fù)性良好。

表3 異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中甲苯咪唑的回收率和變異系數(shù)

2.3 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律

分別口灌20、10、5 mg/kg 甲苯咪唑后，異育銀鯽血液、肝胰臟、腎臟中的藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2～圖4。3種質(zhì)量濃度甲苯咪唑分別在血液、肝胰臟和腎臟中的藥時(shí)曲線(xiàn)變化基本一致，均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。

由圖2可見(jiàn)，口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時(shí)，異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g；24 h后異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量則開(kāi)始迅速下降?？诠嗖煌瑒┝亢?，甲苯咪唑在異育銀鯽組織中含量分布為肝胰臟>腎臟>血液。

圖2 不同劑量下異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

由圖3可見(jiàn)，口灌質(zhì)量濃度為20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時(shí)，異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量達(dá)最大值，分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL，0～24 h異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量呈上升趨勢(shì)，達(dá)到最高峰后甲苯咪唑含量則開(kāi)始下降，在84 h時(shí)甲苯咪唑在異育銀鯽血液中幾乎被代謝完全。

圖3 不同劑量下異育銀鯽血液中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

由圖4可見(jiàn)，口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑后，肝胰臟中甲苯咪唑含量呈先升后降的趨勢(shì)，在24 h時(shí)甲苯咪唑含量達(dá)最高值，分別為8.2248、3.3963、0.5744 μg/g；24 h后肝胰臟中的甲苯咪唑則被逐漸代謝掉，到84 h時(shí)，肝胰臟中的甲苯咪唑含量幾乎被代謝完全。

圖4 不同劑量下異育銀鯽肝胰臟中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

用DAS 3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析藥代數(shù)據(jù)后所得的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4?？诠?0、10、5 mg/kg甲苯咪唑后，異育銀鯽血液中甲苯咪唑峰質(zhì)量濃度分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL，達(dá)峰時(shí)間均為24 h，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～∞)分別為6.497 mg/(L·h)和11.815 mg/(L·h)、1.622 mg/(L·h)和1.648 mg/(L·h)、0.274 mg/(L·h)和0.355 mg/(L·h)，消除半衰期分別為51.788、16.312、43.841 h。肝胰臟中甲苯咪唑峰含量分別為8.2248、3.3963 μg/g和0.5744 μg/g，達(dá)峰時(shí)間均為24 h，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～∞)分別為271.527 mg/(L·h)和284.857 mg/(L·h)、129.337 mg/(L·h)和131.734 mg/(L·h)、27.994 mg/(L·h)和32.123 mg/(L·h)，消除半衰期分別為21.237、12.575、25.02 h。腎臟中甲苯咪唑峰含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g，達(dá)峰時(shí)間均為24 h，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0～∞)分別為161.803 mg/(L·h)和162.531 mg/(L·h)、45.705 mg/(L·h)和45.933 mg/(L·h)、7.396 mg/(L·h)和8.117 mg/(L·h)，消除半衰期分別為9.192、9.326 h和34.914 h。

表4 口灌不同劑量甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟相關(guān)酶活性影響

2.4.1 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶活性呈時(shí)間依賴(lài)性下降(圖5a)。肝胰臟中的堿性磷酸酶活性呈先升后降的趨勢(shì)(圖5b)。在24 h時(shí)堿性磷酸酶活性遠(yuǎn)高于0 h時(shí)，此時(shí)對(duì)照組甲酸對(duì)肝胰臟中堿性磷酸酶活性的影響也較大；48 h時(shí)肝胰臟中堿性磷酸酶活性高于0 h，低于24 h。肝胰臟中過(guò)氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì)，給藥24 h時(shí)，過(guò)氧化氫酶在肝臟中的活性值最高；48 h時(shí)較0 h時(shí)有所升高，較24 h下降(圖5c)。給藥后肝胰臟中超氧化物歧化酶活性先升后降，給藥24 h，肝胰臟中超氧化物歧化酶活性達(dá)最高值；48 h肝胰臟中超氧化物歧化酶活性較0 h時(shí)有所上升，較24 h時(shí)有所下降(圖5d)。

圖5 口灌20 mg/kg甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的變化

2.4.2 口灌甲苯咪唑后異育銀鯽血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性先升后降，給藥24 h時(shí)，血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最高，給藥48 h時(shí)，血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較24 h下降，較0 h上升(圖6)。對(duì)照組口灌甲酸后，對(duì)血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響不大。

圖6 口灌20 mg/kg 甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化

2.5 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽氧化應(yīng)激超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)的影響

口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，肝胰臟中超氧化物歧化酶基因的mRNA水平減少，24 h時(shí)超氧化物歧化酶基因的mRNA水平最低，甲苯咪唑處理組和甲酸對(duì)照組都使超氧化物歧化酶基因表達(dá)下調(diào)(圖7a)。給藥后，甲苯咪唑處理組和甲酸對(duì)照組都使肝胰臟中的過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)下調(diào)；同樣，在24 h時(shí)，過(guò)氧化氫酶基因的mRNA水平達(dá)最小值(圖7b)。

圖7 口灌20 mg/kg甲苯咪唑后異育銀鯽肝胰臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

3 討 論

3.1 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的吸收與分布特征

濫用水產(chǎn)藥物可使魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生耐藥性或藥物殘留在魚(yú)體和人體內(nèi)，很有可能危及人類(lèi)的健康。所以研究藥物在魚(yú)體內(nèi)的代謝及其對(duì)魚(yú)類(lèi)的損傷迫在眉睫。不同時(shí)間甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的分布情況為：在0～24 h之間在體內(nèi)的含量逐步升高，24 h時(shí)達(dá)到最高峰，24 h后開(kāi)始下降。這說(shuō)明口灌24 h內(nèi)，甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)被吸收，24 h后異育銀鯽體內(nèi)的甲苯咪唑不斷發(fā)生代謝?？诠?0 mg/kg甲苯咪唑24 h時(shí)，血液、肝胰臟和腎臟中的甲苯咪唑含量分別為0.1837、8.2248、6.1163 μg/g，84 h時(shí)分別為0.0013、0.4317、0.0623 μg/g?？梢钥闯觯?4 h時(shí)甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)已基本代謝完。這一代謝規(guī)律與文獻(xiàn)[14-15]的論述類(lèi)似：甲苯咪唑在團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)體內(nèi)主要代謝物及其變化規(guī)律，在給藥24 h，體內(nèi)的甲苯咪唑含量也不斷增高，在24 h含量達(dá)到峰值；在復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，前期復(fù)方甲苯咪唑在體內(nèi)快速吸收達(dá)到峰值后，藥物開(kāi)始在體內(nèi)代謝；在96 h時(shí)復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)幾乎被代謝完全。

本試驗(yàn)中，給藥24 h時(shí)，魚(yú)體各組織中甲苯咪唑達(dá)到峰值的順序?yàn)椋焊我扰K>腎臟>血液，肝臟中的甲苯咪唑吸收最快，分布最多，而血液中甲苯咪唑的含量低于肝胰臟和腎臟。這可能是因?yàn)楦我扰K是主要的解毒器官，相比其他組織吸收更快；其次可能是因?yàn)榧妆竭溥蛉芙舛鹊?，在腸壁和肝臟中存在著首過(guò)效應(yīng)[13]，所以大部分藥物主要存在于肝胰臟或者腎臟中，所以推測(cè)甲苯咪唑的吸收和分布情況可能與藥物的理化性質(zhì)和魚(yú)體組織器官有關(guān)[16]。此次對(duì)甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥代研究也給有關(guān)部門(mén)制定甲苯咪唑最高殘留量以及休藥期提供了參考。

3.2 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽的肝毒性分析

正常情況下，動(dòng)物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng)呈穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)外界有毒物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，破壞動(dòng)物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生過(guò)多的自由基，機(jī)體內(nèi)有關(guān)酶性和非酶性抗氧化系統(tǒng)就會(huì)清除過(guò)多的自由基[17]。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶，是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線(xiàn)。超氧化物歧化酶是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分[18]，它的作用原理是催化超氧化物自由基成為過(guò)氧化氫，再在過(guò)氧化氫酶的作用下將過(guò)氧化氫還原為水。由圖5c、d可知，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì)，在24 h時(shí)，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性達(dá)最高值。這可能是由于肝臟是機(jī)體內(nèi)的主要解毒器官，甲苯咪唑含量也最高，所以產(chǎn)生的活性氧較多所致。此時(shí)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，清除體內(nèi)過(guò)多的自由基。在48 h時(shí)機(jī)體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性相對(duì)于24 h而言酶活性被抑制，這可能與過(guò)量的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19]。過(guò)氧化氫酶的活性降低也可能是因?yàn)槌趸锲缁富钚越档蛯?dǎo)致的過(guò)氧自由基過(guò)多[20]。有研究報(bào)道，過(guò)多的超氧陰離子可以抑制過(guò)氧化氫酶的活性[21]。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶也是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，能清除機(jī)體中的過(guò)氧化氫和細(xì)胞膜中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能完整、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗病的作用[22-23]。由圖5a可知，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楣入赘孰倪^(guò)氧化物酶在解毒的過(guò)程中活性受到了抑制。由圖7a、b可見(jiàn)，口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，超氧化物歧化酶基因的mRNA水平呈先下降后上升的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦闻K中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性增加。Jin等[24]將小鼠長(zhǎng)期暴露于Pb中，小鼠的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶發(fā)生劑量依賴(lài)性降低，與本試驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似。堿性磷酸酶是機(jī)體在代謝或抗氧化過(guò)程中關(guān)鍵酶，是磷代謝重要酶類(lèi)之一，主要存在于骨骼、肝臟等地方，與生物體的成長(zhǎng)密切相連[25-26]。由圖5b可知，肝胰臟中堿性磷酸酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì)。在24 h時(shí)堿性磷酸酶活性達(dá)最高值，在48 h時(shí)堿性磷酸酶活性相較24 h時(shí)下降，這提示了肝胰臟中的堿性磷酸酶活性受甲苯咪唑的含量和給藥的時(shí)間影響。先升后降的趨勢(shì)是動(dòng)物對(duì)毒物的反應(yīng)形式，即拋物線(xiàn)形式；拋物線(xiàn)頂點(diǎn)是動(dòng)物對(duì)毒物的最大反應(yīng)值[27]。在24 h時(shí)，異育銀鯽肝胰臟中的甲苯咪唑含量最高，這使得24 h堿性磷酸酶的活性相較于0、48 h而言最高。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是動(dòng)物體內(nèi)重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，其活性變化也反映肝細(xì)胞受損的情況。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細(xì)胞漿中，谷草轉(zhuǎn)氨酶則主要存在于線(xiàn)粒體中[28-29]，在血清中的含量很少，當(dāng)肝臟受損時(shí)，細(xì)胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)釋放到血液中，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性增加[12]。由圖6a、6b可知，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢(shì)是先升后降。在24 h時(shí)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最高，這可能是因?yàn)樵?4 h時(shí)，肝臟中的甲苯咪唑含量最高，肝細(xì)胞受損比較嚴(yán)重，細(xì)胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中，使血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性升高。這與盧敬讓等[30]的研究結(jié)果類(lèi)似。在48 h時(shí)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性相較24 h時(shí)下降，較0 h時(shí)上升。這可能是因?yàn)?8 h時(shí)肝胰臟中的甲苯咪唑被代謝掉，毒性相較24 h時(shí)降低了，所以此時(shí)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性低于24 h時(shí)，但要高于0 h時(shí)。本試驗(yàn)結(jié)果提示，不應(yīng)長(zhǎng)期使用甲苯咪唑防控寄生蟲(chóng)，需要在藥物使用后進(jìn)行藥物保肝處理；在肝膽綜合征和鯽皰疹病毒并發(fā)期應(yīng)慎用甲苯咪唑。