魚源致病性類志賀鄰單胞菌的研究進展

陳美群，王冬平，潘瑛子，張 馳，扎西拉姆，田 云

( 1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128 )

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)為腸桿菌科、鄰單胞菌屬內(nèi)唯一種[1]，廣泛分布于自然界，是一種全球性分布細菌，水生態(tài)環(huán)境是其主要儲存地，而魚類是其常見宿主，可通過受污染的水、魚及貝類感染人類[2-6]。類志賀鄰單胞菌是一種人—獸—魚共患病原菌[7]，可導(dǎo)致魚類等水產(chǎn)動物疾病頻發(fā)，同時也可引起人類的腸胃炎、敗血癥、腦膜炎、腹瀉和食物中毒等疾病[8-10]，因此受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

1 分類和命名

類志賀鄰單胞菌最早由Ferguson等[11]于1947年從一位腸胃炎患者糞便中分離得到，被標(biāo)志為C27副大腸菌，屬腸桿菌科。1957年根據(jù)其有端生鞭毛的特征將其歸入假單胞菌屬(Pseudomonas)，改稱為類志賀假單胞菌(Pseudomonasshigelloides)[12]。1962年Habs等研究發(fā)現(xiàn)，此菌在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖，形態(tài)上并不嚴(yán)格呈逗點狀、端生鞭毛，不產(chǎn)明膠酶、蛋白酶、脫氧核糖核酸酶等胞外酶的特性，將其歸為弧菌科的一個新屬(即鄰單胞菌屬)，由于該菌與宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)Ⅰ型有共同抗原，故命名為類志賀鄰單胞菌[13]。該菌曾長期被劃歸到弧菌科，后隨著脫氧核糖核酸雜交、全基因組序列分析等多相分類鑒定技術(shù)的發(fā)展，在2005年第二版《伯吉氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》中，又將類志賀鄰單胞菌確立為腸桿菌科，鄰單胞菌屬的唯一種[1]。

2 生物學(xué)特性

2.1 形態(tài)特征

類志賀鄰單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，菌株為末端圓形直桿狀，無芽胞，莢膜或有或無[14-15]，大小通常為(0.8～1.0) μm×3.0 μm[15]，呈單、雙或短鏈狀排布，叢生鞭毛或單生鞭毛[13-15]。該菌在營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好，菌落呈圓形、微隆起、表面濕潤光滑，邊緣整齊，不同來源的菌株在營養(yǎng)瓊脂上菌落顏色有差異，異育銀鯽來源的菌株菌落呈灰白色半透明狀菌落[15]，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)來源的菌株菌落呈米黃色半透明狀[16]，黑莓鱸(Pomoxisnigromacufastus)來源的菌株菌落呈淡黃色不透明[17]；在血瓊脂上菌落呈灰白色，一般無溶血現(xiàn)象[15]，偶有微溶血現(xiàn)象[16]；在麥康凱瓊脂菌落呈無色透明[15]；在沙門氏菌(Salmonella)—志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂)上呈無色、圓形、半透明狀的小菌落，中心呈桔黃色[15]；在腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形、米黃色不透明，表面光滑濕潤、微隆起、邊緣整齊[2]；在TSA瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、白色不透明、表面濕潤、中間凸起、邊緣整齊[5]；在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS)培養(yǎng)基上不能生長[13]。不同來源的菌株或培養(yǎng)條件的差異都有可能會導(dǎo)致其細胞和菌落形態(tài)、鞭毛數(shù)目及著生情況發(fā)生變化[15]。

2.2 培養(yǎng)特性

類志賀鄰單胞菌為兼性厭氧菌，溫度、pH、氯化鈉含量對該菌的生長均有影響。Miller等[18]研究表明，類志賀鄰單胞菌對溫度、pH、鹽度的適應(yīng)范圍較廣，在溫度8～45 ℃、pH 4.0～9.0的條件下均可生長，耐受鹽度20.0～30.0，對營養(yǎng)要求較低。陳林等[14]研究斑點叉尾(Ietaluruspunetaus)來源的類志賀鄰單胞菌的最適生長條件，發(fā)現(xiàn)在不添加氯化鈉的普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH 7.03)中，37 ℃時生長速度最快；鹽度為0～2.5的普通營養(yǎng)肉湯中均可生長，其中在鹽度1.5～2.0時生長最好；在pH為5～10的普通營養(yǎng)肉湯(含氯化鈉0.5 g)中均可生長，其中以pH 6.5～8.0時生長最好。 劉志剛等[19]對羅非魚來源的類志賀鄰單胞菌研究表明，該菌株在溫度25～37 ℃、pH 5.0～8.0和鹽度0～11內(nèi)生長良好，其最適生長條件為溫度37 ℃、pH 8.0和鹽度5。

2.3 主要生理生化特性

關(guān)于類志賀鄰單胞菌生理生化特征的研究較多，綜合相關(guān)研究總結(jié)類志賀鄰單胞菌主要生化特征為：氧化酶陽性，能分解發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸鹽還原、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶陽性。產(chǎn)吲哚，不產(chǎn)脂酶、色氨酸脫氨酶，明膠液化、V-P試驗、硫化氫等指標(biāo)陰性(表1)，不同來源菌株間生化特征略有差異[5,14-17,19-21]。

表1 類志賀鄰單胞菌主要生理生化特征

2.4 血清型特征

1959年Sakazaki等[22]首先分析了類志賀鄰單胞菌的血清學(xué)分型，將22株類志賀鄰單胞菌分為5種菌體(O)抗原和4種鞭毛(H)抗原。1978年Shimada等[23]對87株類志賀鄰單胞菌進行了血清學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了30個O抗原和11個H抗原，后續(xù)研究又將類志賀鄰單胞菌血清型發(fā)展到50種O抗原(O1～50)和17種H抗原[24]。1988年楊正時等[25]新發(fā)現(xiàn)了5種新的O 抗原(Oy51～Oy55)。2000年Aldová等[26]將類志賀鄰單胞菌血清學(xué)分型分為102種O抗原和51種H抗原。目前，我國對魚類來源的類志賀鄰單胞菌血清學(xué)分型研究較少，王宇等[27]將從鄭州集貿(mào)市場161份食用淡水魚類樣品中檢出的18株類志賀鄰單胞菌分為O3、O5、O15、O19、O27、O49等6種血清型。劉永大等[28]從撫順地區(qū)市售淡水魚中分離到123株類志賀鄰單胞菌分為21個血清型。梁玉裕等[29]對廣西地區(qū)類志賀鄰單胞菌調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)自人體檢出的11株類志賀鄰單胞菌分屬于O1、O4、O8、O13、O15、O35、O43等7種血清型，同時這些血清型從魚類或水體中均能檢出，說明人源菌株與魚類攜帶菌株有著密切聯(lián)系，類志賀鄰單胞菌可通過被污染的魚或水體而感染人類。

3 流行規(guī)律及致病特征

類志賀鄰單胞菌是一種條件致病菌，一旦環(huán)境適宜就會發(fā)生作用，發(fā)病后可對魚類等水產(chǎn)動物造成極大危害，其感染死亡率高達60%～100%[14-15,21]。類志賀鄰單胞菌的適宜水溫為25～37 ℃，每年夏秋季(4—8月)為魚類疫情高發(fā)期[2,14,19]，并可通過被該病原菌污染的水體快速傳播，導(dǎo)致該病原菌的大范圍流行[14,20]。同時，該菌對溫度、pH、鹽度和營養(yǎng)的適應(yīng)范圍較廣，使其在各種水體和不同季節(jié)均能存活[19]，筆者從西藏拉薩國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地(水溫12 ℃)人工馴養(yǎng)的患病西藏裂腹魚(Schizothoraxwaltoni)中也分離到該菌[30]。大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的魚類更易感染類志賀鄰單胞菌[2,31]，尤其是在成魚個體中，對魚苗也有一定的影響。攜菌魚類發(fā)病時出現(xiàn)急性大面積暴發(fā)和死亡的現(xiàn)象比較少，患病魚類從發(fā)病到死亡時間一般約 1～7 d[20]，部分魚類從感染類志賀鄰單胞菌到發(fā)病死亡可持續(xù)一個月之久[16]。

近年來，有關(guān)類志賀鄰單胞菌對魚類致病性的研究報道逐漸增多，該菌對不同魚類的致病癥狀稍有差異(表2)，這可能是由于魚種和養(yǎng)殖環(huán)境以及菌株差異所致。魚類感染初期主要表現(xiàn)為輕微浮頭和游動無力，反應(yīng)遲鈍并伴有攝食減少的現(xiàn)象[20]。隨著感染程度的增加，魚類體表出現(xiàn)潰爛出血、肝臟腫脹并有出血點、魚鰭潰爛出血、腹腔有腹水、肛門紅腫有時伴有分泌物流出、膽囊和脾臟也有不同程度的腫大等癥狀(表2)。目前，關(guān)于魚源類志賀鄰單胞菌的致病機理研究較少。Ciznár等[32]通過分析不同來源的類志賀鄰單胞菌，明確該菌只產(chǎn)生低水平的彈性蛋白水解酶、蛋白酶和組氨酸脫羧酶，而三酰甘油脂肪酶活性相對較高，其毒力因子可能與菌的表面性質(zhì)主要是疏水性、鞭毛運動、組氨酸脫羧酶、三酰甘油脂肪酶和溶血性等相關(guān)。Tsugawa等[33]對類志賀鄰單胞菌細胞毒性外膜蛋白(ComP)的基本結(jié)構(gòu)和功能研究表明，ComP可能是引起感染后宿主細胞死亡的主要毒力因子。陳林等[14]從患病斑點叉尾來源的類志賀鄰單胞菌中也檢測到ComP基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有一定的致病力。Ekundayo等[34]采用比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，鄰單胞菌屬菌株的開放閱讀框(ORFs)與其他病原體中鑒定的毒力基因同源或直系同源，證實了類志賀鄰單胞菌具有致病能力，可能具有與腸外感染相關(guān)的毒力因子(VFs)。張明洋等[35]指出類志賀鄰單胞菌的毒力因子除類霍亂毒素、細胞毒素和溶血素外，還發(fā)現(xiàn)有2種熱穩(wěn)定性不同的腸毒素：類志賀鄰單胞菌的外毒素及菌體裂解釋放的內(nèi)毒素，可造成嚴(yán)重的組織損傷，這可能是該菌引起消化道病變的主要原因之一。劉志剛等[19]研究表明，類志賀鄰單胞菌感染尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)后，導(dǎo)致魚腸組織中腸絨毛膜上皮細胞脫落，局部淋巴細胞浸潤，黏膜上皮中杯狀細胞腫脹及數(shù)量增多；部分肝細胞壞死，細胞核溶解，大量肝細胞出現(xiàn)空泡化；脾臟組織中淋巴細胞增多，多點出血；腎臟組織中腎小管管壁細胞裂解，腎小管結(jié)構(gòu)被破壞；心肌細胞變大，細胞核增大，染色加深等。類志賀鄰單胞菌對魚類危害較大，有必要進一步開展其致病機理方面的研究。

表2 類志賀鄰單胞菌的主要魚類來源及其致病特征

(續(xù)表2)

4 藥敏特性及防治措施

有關(guān)類志賀鄰單胞菌藥敏特性及毒力因子的研究報道較多，龍?zhí)K等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚致病性類志賀鄰單胞菌對先鋒Ⅵ、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、先鋒必、氟苯尼考等16 種藥物都高度敏感，對青霉素G和氨芐青霉素具有較強的耐藥性。劉志剛等[19]對尼羅羅非魚致病性類志賀鄰單胞菌的藥敏結(jié)果表明，該菌已呈現(xiàn)多重耐藥性，僅對頭孢曲松、頭孢唑啉等7種抗生素敏感。張效平等[5]發(fā)現(xiàn)，江鱈源類志賀鄰單胞菌對頭孢曲松、先鋒Ⅵ、卡那青霉素、慶大霉素等呈現(xiàn)多重耐藥特征，但對四環(huán)素、氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等13種藥物較敏感。楊虹等[45]對分離自廣東省不同地區(qū)的患病鱖魚(Sinipercachuatsi)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)和烏鱧(Channaargus)的55株類志賀鄰單胞菌研究表明，上述類志賀鄰單胞菌對克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林的耐藥性較高，TEM、gyrB和tetR等耐藥基因檢出率分別為18.2%、67.3%和36.4%，其中39株致病菌至少含有1種耐藥基因。2018年Hossam等[46]首次報道了自1尾患病鲇魚中分離到的多重耐藥類志賀鄰單胞菌菌株MS-17-188的完整基因組序列，這對于研究該菌株耐藥的分子機制具有重要意義。Martins等[47]描述了從羅非魚中分離到1株耐四環(huán)素的類志賀鄰單胞菌FM82菌株的基因組草圖序列，該菌株攜帶有抗菌素耐藥性、生物膜和CRISPR相關(guān)基因。Martins等[48]報道，從巴西里約熱內(nèi)盧州的天然池塘魚體中分離到耐藥性較強的類志賀鄰單胞菌，其中大部分類志賀鄰單胞菌對四環(huán)素具有耐藥性，小部分對氯霉素耐藥，且這些耐藥類志賀鄰單胞菌均有耐四環(huán)素或氯霉素的耐藥基因。鄒升等[43]從環(huán)洞庭湖區(qū)患病草魚腸道中分離得到類志賀鄰單胞菌，該菌對紅霉素、多黏菌素、利福平、萬古霉素、氨芐西林、慶大霉素和卡那霉素產(chǎn)生較高的耐藥性，并檢測到S-核糖基高半胱氨酸酶和黏附素等毒力因子。豆朋朋等[44]對分離自患病黃顙魚的類志賀鄰單胞菌菌株L-1研究表明，該菌株對頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，對四環(huán)素中度敏感，對苯唑西林、氨芐西林等耐藥。同時，該菌株檢出Sul2、TEM、ant(3″)-Ⅰa和aac(6′)-Ⅰb等4種耐藥基因。上述研究表明，不同菌株間的藥敏特性及耐藥特征具有一定差異，這些差異可能與菌株所處環(huán)境、宿主來源、抗生素環(huán)境等因素有關(guān)。

抗生素等藥物的廣泛使用可誘導(dǎo)類志賀鄰單胞菌產(chǎn)生耐藥性，同時耐藥基因水平擴散或垂直傳播亦可導(dǎo)致該菌耐藥性增強，加大了該菌的防控難度[45]，所以近年來針對類志賀鄰單胞菌的新防控措施逐漸增多。賴曉健等[38]對太平洋雙色鰻鱺來源的類志賀鄰單胞菌研究表明，五倍子、丁香和生地榆等中藥提取物對該菌株具有較好的抑菌效果。李赫等[49]利用16種中草藥提取物對類志賀鄰單胞菌的體外抑菌研究顯示，丁香對類志賀鄰單胞菌的抑菌效果最好，其最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為31.25 mg/mL，黃芪次之，其最小抑菌質(zhì)量濃度為62.5 mg/mL。Nisha等[50]從發(fā)酵大米中分離到一株假單胞菌BPH2益生菌，BPH2對類志賀鄰單胞菌具有很強的抑制作用，該益生菌可有效地應(yīng)用于水、土壤等養(yǎng)殖系統(tǒng)中，控制魚類的細菌性病害。Gong等[51]從土壤中分離到一株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)SL001，其對類志賀鄰單胞菌具有較強的抑菌作用，該菌可提高草魚的免疫力并提高其生長速度。益生菌資源的挖掘與利用將是今后一段時期控制水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的重要手段，有利于減緩病原菌的耐藥性變異，提高病原菌的防控效果，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

5 展 望

目前，對從急性腹瀉、食物中毒的患病人群中分離的類志賀鄰單胞菌的致病機理的研究相對較多，但對從病魚中來源的類志賀鄰單胞菌的致病機理的研究較少。由于近年來由該菌引起的養(yǎng)殖魚類患病較為頻繁[52]，且對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失，因此有必要對魚源致病性類志賀鄰單胞菌的分子分型、致病機理和防控措施等進行深入研究，這對明確該菌對魚類的致病性并控制其傳播及流行具有重要的意義。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素經(jīng)常被用來控制由細菌引起的傳染病，但是抗生素的大量使用和長期反復(fù)使用容易造成細菌產(chǎn)生耐藥性[53]，還會對水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品和環(huán)境造成藥物殘留問題，為此積極開發(fā)早期預(yù)防疫苗、快速診斷試劑盒、非抗生素新型藥物等都具有廣闊前景。此外極有必要開展拮抗菌等新型防治措施研究，分析拮抗菌的次級代謝產(chǎn)物及其對類志賀鄰單胞菌的抑菌活性，以期找到對該菌具有較好抑制作用的新型活性物質(zhì)[54]，為傳統(tǒng)魚類抗生素藥物的替代提供研究基礎(chǔ)。