微波輔助提取麻城福白菊綠原酸工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性

汪芷玥 周際松 湯凱

摘要：湖北省麻城福白菊為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)物，綠原酸是其中含量較高的生物活性物質(zhì)。采用微波輔助提取法對其中的綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定綠原酸的總抗氧化能力及其清除超氧陰離子自由基的能力。選取微波時間、微波功率、料液比等3個變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)組合：微波功率為640 W，料液比為1 g ∶ 20 mL，微波時間為25 s。在此最優(yōu)條件下，綠原酸提取率可達(dá)6.25%?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，福白菊中綠原酸具有良好的抗氧化性，并且當(dāng)福白菊中綠原酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，其總抗氧化能力及清除超氧陰離子自由基的能力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：菊花;綠原酸;微波輔助提取;響應(yīng)面法;抗氧化活性

中圖分類號： TS201.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0240-06

麻城福白菊（Chrysanthemum morifolium cv. Fubaiju）是一種兼具食用和藥用價值的保健型藥材，被視為“藥膳佳肴，飲中極品”，主要種植于以湖北省麻城市福田河鎮(zhèn)為中心的大別山區(qū)域[1]。憑借當(dāng)?shù)亓己玫纳鷳B(tài)環(huán)境及地理優(yōu)勢，麻城福白菊被評為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)物，具有清熱解毒、平肝明目的功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，福白菊中綠原酸、木樨草苷等成分含量均高于其他種菊花[3]。而在福白菊的眾多提取物中，綠原酸是其發(fā)揮一定功效的主要活性成分。綠原酸是一種苯丙素類物質(zhì)，具有抗菌、降壓、利膽、抗氧化等作用[4-5]，它在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用[6]，被稱為“植物黃金”[7]。近幾年來，隨著人們對生物資源的重視，綠原酸的提取工藝受到廣泛關(guān)注。麻城福白菊作為大別山優(yōu)質(zhì)特色資源，是獲取綠原酸的良好來源。

目前，國內(nèi)外對麻城福白菊遺傳特性的研究較多[8]，而對其活性成分的研究相對較少[9]，麻城福白菊的豐厚資源尚未得到充分利用。本研究采用微波輔助提取的方法從麻城福白菊中提取綠原酸，選擇微波時間、微波功率、料液比等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化福白菊中綠原酸的最佳提取工藝，同時探究福白菊中綠原酸的抗氧化活性，以期為后續(xù)麻城福白菊的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑 福白菊，產(chǎn)自湖北省麻城市福田河鎮(zhèn);無水乙醇、維生素C、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、焦性沒食子酸等（均為分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥基氨基甲烷（分析純），購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;鹽酸（分析純），購自中平能化集團(tuán)開封東大化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 FW100高速萬能粉碎機(jī)，購自天津市泰斯特儀器有限公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，購自上虞市五四紗篩廠;AL204電子天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;WBFY-201微波化學(xué)反應(yīng)器、SHZ-D（Ⅲ）環(huán)水真空泵，均購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;723型可見分光光度計(jì)，購自上海光譜儀器有限公司;H/T18MM臺式高速離心機(jī)，購自湖南赫西儀器裝備有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋，購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸的提取工藝流程 將已經(jīng)干燥的麻城福白菊放入粉碎機(jī)中粉碎后過80目篩備用。準(zhǔn)確稱取0.5 g福白菊粉末和80%乙醇溶液，按照一定的配比混合后移入微波反應(yīng)器中，設(shè)置一定的微波時間、微波功率，對其中的綠原酸進(jìn)行提取。將處理好的溶液進(jìn)行抽濾，再將濾液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，加80%乙醇溶液定容，搖勻。用移液管移取1 mL溶液于100 mL容量瓶中，加80%乙醇溶液定容。以80%乙醇溶液作為空白對照，于分光光度計(jì)中測定待測液在328 nm波長下的吸光度[10]。

1.2.2 綠原酸提取率的計(jì)算 利用綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在328 nm波長下測定吸光度，根據(jù)所得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式D=41.757C+0.0387及公式（1）計(jì)算綠原酸提取率（y）[11]：

y=CVn/m×100%。（1）

式中：D為吸光度;C為綠原酸濃度，mg/mL;V為體積，L;n為稀釋倍數(shù);m為福白菊粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 微波時間對福白菊綠原酸提取率的影響 分別稱取0.5 g福白菊粉與80%乙醇溶液，按照料液比1 g ∶ 20 mL混合，設(shè)定微波功率為400 W，在微波時間分別為10、20、30、40、50 s的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在328 nm波長下測定其吸光度，并計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.3.2 料液比對福白菊綠原酸提取率的影響 分別稱取0.5 g福白菊粉與80%乙醇溶液，按照設(shè)定的料液比混合，設(shè)定微波時間為30 s，微波功率為400 W，在料液比分別為1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在328 nm波長下測定其吸光度，并計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.3.3 微波功率對福白菊綠原酸提取率的影響 分別稱取0.5 g福白菊粉與80%乙醇溶液，按照料液比1 g ∶ 20 mL混合，設(shè)定微波時間為30 s，在微波功率分別為80、240、400、640、800 W的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在328 nm波長下測定其吸光度，并計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、微波功率、微波時間等3個因素為自變量，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，用Box-Behnken design法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，得出微波輔助提取麻城福白菊中綠原酸的最佳工藝條件[12]。試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.5 福白菊中綠原酸抗氧化活性的測定方法 總抗氧化能力測定方法[13]：取0.2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液，分別加入2.5 mL磷酸鹽溶液（pH值為6.6）和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。混勻后于1 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，加入5 mL蒸餾水和 1 mL 0.1% FeCl3溶液，充分振蕩后，于分光光度計(jì)中在700 nm波長下測定待測液吸光度，并以相同濃度的維生素C溶液作為陽性對照。吸光度越高，表明其總抗氧化能力越強(qiáng)。

超氧陰離子清除能力測定方法[14]：取0.2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液，加入5.7 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8.2），于25 ℃水浴10 min，再加入0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚。迅速搖勻后于分光光度計(jì)中在320 nm波長下測定反應(yīng)時間為1 min時的吸光度Dx，同時以等濃度的樣品溶液作為參比，以扣除樣品本身所帶的顏色干擾;用等體積的水代替樣品，以Tris-HCl作為空白參比，測定反應(yīng)時間為 1 min 時的吸光度D0，并以相同濃度的維生素C溶液作為陽性對照。在320 nm波長下，福白菊中綠原酸對超氧陰離子的清除能力計(jì)算公式如下：

清除率=（D0-Dx）/D0×100%。（2）

式中：D0為Tris-HCl空白對照液的吸光度;Dx為樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對福白菊綠原酸提取率的影響 在料液比為 1 g ∶ 20 mL、微波時間為30 s的固定條件下，改變微波功率，研究其對綠原酸提取率的影響。由圖1可知，微波功率在80～400 W范圍內(nèi)時，隨著微波功率的增加，提取率升高;當(dāng)微波功率為400 W時，綠原酸提取率達(dá)到最大值（5.75%）;當(dāng)微波功率繼續(xù)增加時，綠原酸提取率呈現(xiàn)出下降的趨勢，這是由于當(dāng)微波功率過大時，溫度升高導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)遭到破壞[15]，從而影響了福白菊中綠原酸的提取率。

2.1.2 微波時間對綠原酸提取率的影響 在料液比為 1 g ∶ 20 mL、微波功率為400 W的固定條件下，改變微波時間，研究其對綠原酸提取率的影響。由圖2可知，當(dāng)微波功率為10～20 s時，綠原酸提取率隨微波時間的增加而升高;當(dāng)微波時間為20 s時，綠原酸提取率達(dá)到最大值（5.79%）;當(dāng)微波時間繼續(xù)增加時，綠原酸提取率呈現(xiàn)出下降的趨勢，這是由于微波時間過長時，微波能量聚集，使得細(xì)胞壁迅速破裂，水分立即蒸發(fā)，綠原酸來不及融入乙醇[16-17]，另一方面，由于乙醇具有揮發(fā)性，隨著微波時間的延長，其有效濃度也逐漸降低，從而影響了提取率。

2.1.3 料液比對綠原酸提取率的影響 在微波功率為400 W、微波時間為30 s的固定條件下，改變料液比，研究其對綠原酸提取率的影響。由圖3可知，當(dāng)提取料液比為1 g ∶ 10 mL至1 g ∶ 20 mL時，綠原酸提取率隨之升高;當(dāng)料液比為 1 g ∶ 20 mL 時，綠原酸提取率達(dá)到最大值（6.03%）;當(dāng)料液比為 1 g ∶ 25 mL 至1 g ∶ 30 mL時，綠原酸提取率呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因?yàn)楫?dāng)福白菊原料減少時，提取得到的綠原酸也減少。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對3個因素[微波時間（A）、微波功率（B）、料液比（C）]，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到綠原酸提取率（Y）與微波時間（A）、微波功率（B）和料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型方程為

Y=6.25+0.029A+0.065B+0.069C+0.022AB+0.22AC-0.058BC-0.22A2-0.10B2-0.13C2。

對該模型進(jìn)行方差分析，由表3可知，該模型（P<0.000 1）極顯著;失擬值不顯著（P=0.313 1>0.05），表明該模型不失擬，十分合理;R2=0.980 6，表明該模型的相關(guān)性較好，能良好地反映3個因素與綠原酸提取率之間的關(guān)系;R2adj=0.955 6，表明該模型具有較好的相關(guān)性[18]。綜上，可運(yùn)用該模型對福白菊中的綠原酸進(jìn)行分析和檢驗(yàn)。在一次項(xiàng)中，A（微波時間）對綠原酸提取率的影響不顯著，B（微波功率）和C（料液比）對綠原酸提取率的影響極顯著（P<0.01）[19];在交互項(xiàng)中，AB對綠原酸提取率的影響不顯著（P=0.098 9>0.05），BC對綠原酸提取率的影響顯著（P<0.05），AC對綠原酸提取率的影響極顯著（P<0.000 1），表明微波時間和料液比、微波功率和料液比之間存在交互作用;在二次項(xiàng)中，A2、B2、C2對綠原酸提取率的影響皆表現(xiàn)為極顯著（P<0.01）。3個因素對福白菊綠原酸提取率的影響主次順序表現(xiàn)為料液比>微波功率>微波時間。

優(yōu)化得到的麻城福白菊中綠原酸微波輔提的最佳參數(shù)組合：微波功率為640 W，料液比為 1 g ∶ 20 mL，微波時間為25 s，在該條件下，綠原酸提取率的理論值為6.28%。

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面及等高線可直觀清晰地反映2個因素之間的交互作用，當(dāng)響應(yīng)面越趨近平面時，表明2個因素之間的交互作用越弱;當(dāng)響應(yīng)面越趨近拱形時，表明2個因素之間的交互作用越強(qiáng);當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)橢圓形時，表明2個因素之間的交互作用較強(qiáng)，對綠原酸提取率的影響顯著[20]。

由圖4-a可知，在微波時間和微波功率對綠原酸提取率的影響方面，對應(yīng)的響應(yīng)面較平緩，表明微波時間和微波功率之間的交互作用不顯著[20];圖4-c中的響應(yīng)面趨近拱形，等高線較密集，呈現(xiàn)橢圓形，表明微波時間和料液比之間的交互作用顯著;圖4-e的響應(yīng)面坡度較陡，圖4-f的等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明微波功率與料液比之間的交互作用較明顯。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到最佳工藝條件：微波時間為25 s，微波功率為640 W，料液比為1 g ∶ 20 mL，在此條件下綠原酸的理論提取率為6.28%。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得綠原酸的實(shí)際提取率為6.25%，與預(yù)測結(jié)果基本一致，可見該模型有效。

2.3 福白菊中綠原酸抗氧化活性的測定

2.3.1 總抗氧化能力測定結(jié)果 如圖5所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，吸光度逐漸提高，即福白菊中綠原酸的總抗氧化能力逐漸增強(qiáng)[21];當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，吸光度達(dá)到最大值，在該濃度下綠原酸的總抗氧化能力最強(qiáng)，與同濃度下維生素C溶液的總抗氧化能力比較可知，福白菊中綠原酸有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3.2 超氧陰離子清除能力測定結(jié)果 如圖6所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，福白菊中綠原酸對超氧陰離子的清除能力逐漸增強(qiáng);當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，清除率達(dá)到88.97%，與該濃度下維生素C對超氧陰離子的清除率基本持平。以上結(jié)果表明，福白菊中綠原酸對超氧陰離子有較強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

綜上，以麻城福白菊為原料，以福白菊中綠原酸的提取率為指標(biāo)，利用微波輔助提取的方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法得到提取麻城福白菊中綠原酸的最佳工藝條件：微波功率為640 W，微波時間為25 s，料液比為1 g ∶ 20 mL。綠原酸提取率在該條件下可達(dá)6.25%。與其他方法相比，微波輔助提取法更加簡單、高效，為麻城福白菊中綠原酸的進(jìn)一步開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。另外，當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，其抗氧化能力達(dá)到最大值，是同濃度下維生素C抗氧化能力的79.9%，表現(xiàn)出綠原酸較高的抗氧化能力;在該濃度下，綠原酸對超氧陰離子的清除能力最強(qiáng)，為同濃度下維生素C清除能力的93.7%，表明福白菊中綠原酸對超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除能力，可為后續(xù)利用麻城福白菊研制具有抗氧化活性的產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐 雷，劉常麗，王慧弟，等. 福白菊花粉活力和柱頭可授性研究[J]. 中藥材，2012，35（10）：1546-1550.

[2]秦賀蘭，游 捷，高俊平. 菊花18個品種的RAPD分析[J]. 園藝學(xué)報，2002，29（5）：488-490.

[3]徐 雷，謝彩香，胡志剛，等. 湖北道地藥材福白菊產(chǎn)地生態(tài)適宜性數(shù)值區(qū)劃研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2016，27（4）：954-957.

[4]Yusaku N，Kuniyo I. Inhibitory effects of chlorogenic acids from green coffee beans and cinnamate derivatives on the activity of porcine pancreas α-amylase isozyme I[J]. Food Chemistry，2011，127（4）：1532-1539.

[5]馮 攀. 杜仲葉中綠原酸提取純化綠色工藝的研究[D]. 西安：陜西科技大學(xué)，2014.

[6]Wianowska D，Gil M. Recent advances in extraction and analysis procedures of natural chlorogenic acids[J]. Phytochemistry Reviews，2019，18（1）：273-302.

[7]張 露，陳豆弟. 綠原酸提取工藝研究進(jìn)展[J]. 杭州化工，2012，42（4）：4-6，11.

[8]李 倫，熊永興，趙玉霞，等. 麻城福白菊的ISSR遺傳圖譜的構(gòu)建[J]. 中國藥師，2014，17（12）：2059-2063.

[9]熊永興. 福白菊種質(zhì)資源研究及其優(yōu)良品系的優(yōu)選[D]. 武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[10]常學(xué)峰. 金銀花中綠原酸的提取純化新方法的研究[D]. 青島：中國石油大學(xué)，2013.

[11]張明明，黃 芳，張長麗. 響應(yīng)面法優(yōu)化野菊花中綠原酸的提取工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：327-329.

[12]劉 剛，秦 高，任 雪. 響應(yīng)面法優(yōu)化葵花粕中綠原酸提取工藝[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（21）：11050-11052，11058.

[13]王 化，李夢莎，何丹嬈，等. 3種野生越桔屬植物漿果提取物抗氧化活性比較研究[J]. 中國釀造，2018，37（10）：148-152.

[14]崔珊珊，畢凱媛，吳 杰，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化樹莓鞣花酸提取工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（1）：149-155，161.

[15]帥麗喬娃，鄭國棟，張清峰，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取菝葜綠原酸工藝[J]. 中國食品學(xué)報，2015，15（6）：102-109.

[16]丘秀珍，何慕貞. 微波輔助提取百香果中綠原酸的工藝研究[J]. 韶關(guān)學(xué)院學(xué)報，2012，33（2）：31-34.

[17]Mills C E，Oruna-Concha M J，Mottram D S，et al. The effect of processing on chlorogenic acid content of commercially available coffee[J]. Food Chemistry，2013，141（4）：3335-3340.

[18]張崇軍，唐賢華，趙 龍，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化大曲中黃曲霉毒素B1提取工藝[J]. 中國釀造，2018，37（12）：132-136.

[19]劉振春，錢 月. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波微波輔助提取葵花籽綠原酸工藝[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，44（10）：157-164.

[20]容晨曦，張秀玲，李鐵柱，等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化微波法提取刺玫籽原花青素的工藝[J]. 食品科學(xué)，2016，37（18）：41-46.

[21]郭毓菲，張?jiān)娙?，王漢迪，等. 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性探究[J]. 中國釀造，2018，37（12）：160-164.