隴西縣黃芪白粉病病原鑒定及其生物學特性測定

李金鴻，徐雪芬，李惠霞，羅寧，倪春輝，李文豪，徐志鵬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

黃芪(Astragalusmembranaceus)，多年生草本，高50～100 cm.主根肥厚，木質，常分枝，灰白色.莖直立，上部多分枝，有細棱，被白色柔毛.產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙古、山西、黑龍江等地[1].

甘肅省藥用植物資源豐富，常年種植面積約為14.0萬hm2，約占全國的20%，其中黃芪約占全國總面積和總產(chǎn)值的80%[2].白粉病是黃芪生產(chǎn)中一種常見的葉部病害，對黃芪產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)造成一定的威脅.據(jù)2012年調查,發(fā)病率55.5%～93.0%，嚴重度2～4級,嚴重影響黃芪的產(chǎn)量和品質.徐福祥[3]等報道其主要為害黃芪葉片、葉柄、嫩莖和莢果等部位.初期發(fā)病部位布滿白色粉末狀霉層.以后逐漸擴大蔓延,布滿全葉、莖稈及莢果,整片葉子及莢果被白色粉狀物所覆蓋,后期變黑形成很多小黑點,嚴重時葉片呈黃褐色、干枯,造成早期落葉,葉片和莖稈同時受害,受害重的則整株枯萎.黃芪白粉病病菌于9月下旬形成子囊果,以子囊果在病殘體上越冬[4-5].翌年5月份氣溫達到20℃以上時,病菌孢子萌發(fā),首先感染二年生黃芪植株,出現(xiàn)發(fā)病中心,病菌迅速繁殖,重復侵染,葉片上出現(xiàn)白色粉狀物,病菌孢子借風傳播,并迅速向鄰株蔓延,很快布滿全田[6-8].

楊春清等[9]報道，北京、河北、內(nèi)蒙古等地區(qū)黃芪白粉病病原為豌豆白粉菌(ErysiphePisiDC.)，任舉[10]將甘肅省定西市黃芪白粉病病原鑒定為豌豆白粉菌 (Erysiphepisi) ，駱得功等[11]報道了甘肅省定西市黃芪白粉病的病原為黃芪束絲殼(Trichocladiaastragali)，在內(nèi)蒙古白粉菌志[12]中記錄，將黃芪束絲殼重新命名為黃芪白粉菌(E.astragali)，異名黃芪束絲殼.上述研究均是通過形態(tài)學特征進行鑒定，缺少分子生物學特征的比較.

本試驗擬調查隴西縣黃芪白粉病的發(fā)生情況，通過形態(tài)學結合分子生物學特征鑒定病原種類，并開展病原生物學特性研究，為該病害的及時有效防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 調查方法與樣品采集

1.1.1 調查地概況 隴西縣位于甘肅省定西市中部、渭河上游，地處隴中黃土高原中部，屬溫帶季風氣候，四季分明，日照充足，氣候溫和.年均降水量445.8 mm，蒸發(fā)量1 440 mm，年均日照時數(shù)2 292 h，年均無霜期146 d.

1.1.2 黃芪白粉病調查方法 2018年6～9月，采用五點法取樣，調查隴西縣鞏昌鎮(zhèn)、文峰鎮(zhèn)、雙泉鄉(xiāng)、菜子鎮(zhèn)、福星鎮(zhèn)和首陽鎮(zhèn)等6個鄉(xiāng)鎮(zhèn).每個田塊取5個點，每個點取黃芪10株，觀察葉片的發(fā)病情況，白粉病發(fā)病分級標準見表1.

表1 寄主植物發(fā)病嚴重度的分級標準Table 1 Classification criteria for the severity of host plant disease

植株發(fā)病率(%)=(染病株數(shù)/調查總株數(shù))×100%

1.1.3 供試材料 2018年6～9月采集隴西縣黃芪白粉病葉片，制作臘葉標本，以備形態(tài)學觀測.

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌形態(tài)學觀察 挑取發(fā)病葉片上的粉狀物和子囊果，制成臨時玻片，在顯微鏡(Lab.A1)下觀察并測量有性階段(子囊果形狀、大??；附屬絲長、寬度，顏色；子囊數(shù)量、形狀，子囊孢子的形狀、大小等)和無性階段(菌絲體寬度、形態(tài)；分生孢子梗形狀、大?。环稚咦有螤畲笮。桓街叩男螤?；芽管萌發(fā)位置等)特征[11-16].根據(jù)觀測結果，參照《內(nèi)蒙古白粉菌志》[12]和《中國真菌志·第一卷·白粉菌目》[17]，進行病原菌鑒定.

1.2.2 病原菌分子生物學鑒定 刮取新鮮病葉上的黃芪白粉菌，利用植物基因組DNA提取試劑盒(通用型)，提取菌株DNA組.采用引物ITS1(5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGTTATGC-3′)進行PCR擴增.PCR反應體系：2×Master Mix 25 μL、10 μmmol/L正反向引物各1 μL，基因組DNA 4 μg，雙蒸水補足50 μL.PCR程序:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min[18].擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序.所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST分析，下載高度同源的ITS序列，利用MEGA7軟件采用MEGA7軟件進行最大似然法分析，檢測方法用自展法(Bootstrap)，構建系統(tǒng)進化樹并分析親緣關系，進一步明確病原菌的分類地位[19].

1.2.3 不同溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 用無菌水配制成孢子懸浮液，每視野20～30個分生孢子，滴于凹面載玻片上，后置于15，20，25 ℃下保濕培養(yǎng)，8、16、24、32、40 h后鏡檢并統(tǒng)計萌發(fā)率.每個處理50個孢子，重復3次.

孢子萌發(fā)率 (%) =萌發(fā)的孢子總數(shù)/檢查的孢子總數(shù)×100%[20].

1.2.4 不同pH值對分生孢子萌發(fā)的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制pH值4、6、8、10的緩沖液，將孢子懸浮液(100(下每視野20～30個分生孢子)分別滴于不同pH值溶液的凹面載玻片上，25 ℃保濕培養(yǎng).8、16、24、32、40 h 后鏡檢并統(tǒng)計萌發(fā)率[21].

1.2.5 不同碳源對分生孢子萌發(fā)的影響 用無菌水配制2%無水葡萄糖溶液、2%麥芽糖溶液、2%乳糖溶液和2%甘露醇溶液，將孢子懸浮液(100(下每視野20～30個分生孢子)，滴于凹面載玻片上，分別滴加上述溶液，25 ℃保濕培養(yǎng).8、16、24、32、40 h后鏡檢并統(tǒng)計萌發(fā)率[21].

1.2.6 不同光照條件對分生孢子萌發(fā)的影響 用無菌水配制孢子懸浮液，將其涂在滅菌載玻片上，在25 ℃條件下設日光燈連續(xù)光照、光暗交替(L/D=4 h/4 h)、連續(xù)黑暗3個處理，每隔8 h鏡檢，統(tǒng)計40 h的萌發(fā)率[21].

2 結果與分析

2.1 調查結果

田間調查結果顯示，隴西縣黃芪白粉病平均發(fā)病率為31.17%，平均病情指數(shù)為18.08，6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)大部分黃芪田塊均有不同程度的侵染，鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間白粉病發(fā)病率差異不明顯.6月份黃芪開始受白粉菌侵染，9月份受侵染的葉片部分或整個片覆蓋白粉，達到發(fā)病高峰期.

2.2 白粉菌形態(tài)特征

2.2.1 無性形態(tài)特征 菌絲體葉兩面生，生于葉柄和莖上，形成明顯白色圓形斑片，覆蓋整個葉面，存留或消失；菌絲體淺褐色，粗5～8(～13)μm，附著胞裂瓣狀.分生孢子梗直立，足胞柱狀，(18～)20～43(～49)×(2～)6～8(～12)μm，上接兩個短細胞或1個長細胞(圖1-A)；分生孢子梗大小為(37～)44～83(～98)× 7～14 μm，有1～2個隔膜；分生孢子單生，圓柱形或橢圓形，31～42(～48)×12～18 μm，平均值為38×15 μm(圖1-B)；芽管自頂端萌發(fā)，大小為(3～)11～70(～91)×2～8 μm(圖1-C).

2.2.2 有性形態(tài)特征 子囊果聚生或散生，暗褐色，扁球形，直徑為(86～)114～158(～189)μm，平均為134.752 μm，壁細胞為不規(guī)則多角形(圖2-A)；附屬絲(8～)11～18(～22)根，多數(shù)生于子囊果一側，彎曲程度大，全長近等粗，常與菌絲交織在一起，粗3～8 μm，平均為4.95 μm，頂部稍寬為3～7 μm，平均為5.18 μm，長度為(27～)71～252(～316)μm，平均為141.86 μm，壁薄，光滑或稍粗糙，全長褐色，分支.子囊果內(nèi)含子囊3～8個，子囊球形、不規(guī)則形，有柄，大小為(48～)58～79(～84)×(29～)32～42(～54)μm；子囊內(nèi)含2～5個子囊孢子，子囊孢子呈卵性、球形或橢圓形，大小為10～26×5～18 μm((圖2-B)).

A：分生孢子梗；B：分生孢子；C：芽管；D：附著孢.A：Conidiophores；B：conidia；C：Germ tube；D：Attached spore.圖1 黃芪白粉菌的無性態(tài)特征Figure 1 The asexual characteristics of the powdery mildew on Astragalus membranaceus(Bar=10 μm)

根據(jù)病原形態(tài)特征，查閱相關書籍和資料，初步確定該病原菌為子囊菌門黃芪白粉菌(E.astragali).

2.2.3 分子生物學特征分析 擴增得到的ITS-rDNA序列長度634 bp，將其命名為HQ，GenBank登錄號為MK920921.在GenBank中進行BLAST同源序列比對發(fā)現(xiàn)，該ITS序列(MK920921)與沙打旺上的黃芪白粉菌Erysipheastragali(LC010028.1)ITS序列緊密聚集成一支，相似度為99.19%，遺傳距離最小，親緣關系近，如圖3所示.因此，將該白粉菌鑒定為黃芪白粉菌(E.astragali).

A：子囊果；B：子囊和子囊孢子.A：Ascospores；Bar=50 μm；B：Ascus and ascospores,Bar=10 μm.圖2 黃芪白粉菌的有性態(tài)特征Figure 2 The characteristics of the white powdery mildew

圖3 基于ITS-rDNA序列構建的黃芪白粉病病原菌聚類分析樹狀圖Figure 3 Phylogenetic tree of ITS -rDNA of powder mildew on Astragalus membranaceus

2.3 黃芪白粉菌生物學特性

2.3.1 不同溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 黃芪白粉菌分生孢子在15、20和25 ℃時均能萌發(fā)，隨著培養(yǎng)時間的延長，萌發(fā)率呈增加的趨勢.其中，在25℃條件下，培養(yǎng)40 h時分生孢子萌發(fā)率最高，為32.0%.

2.3.2 同pH值對分生孢子萌發(fā)的影響 白粉菌分生孢子在pH值為4～10條件下均可以萌發(fā)，且隨著時間的延長，萌發(fā)率呈增加的趨勢，其中，在pH值6和8條件下，更有利于孢子的萌發(fā)(圖5).

2.3.3 不同碳源對分生孢子萌發(fā)的影響 通過圖6發(fā)現(xiàn)，2%麥芽糖溶液和2%乳糖溶液對白粉菌分生孢子的萌發(fā)影響不大，而2%葡萄糖溶液和2%甘露醇溶液對白粉菌分生孢子的萌發(fā)具有一定的抑制作用.

圖4 不同溫度對白粉菌孢子萌發(fā)的影響Figure 4 The effect of different temperatures on spore germination of powdery mildew

圖5 不同pH值對白粉菌孢子萌發(fā)影響Figure 5 The effect of different pH on spore germination of powdery mildew

圖6 不同碳源對白粉菌孢子萌發(fā)影響Figure 6 Effects of different carbon sources on the germination of powdery mildew spores

2.3.4 不同光照條件對分生孢子萌發(fā)的影響 全光照的條件下，最有利孢子的萌發(fā)，光照黑暗(L/D=4 h/4 h)相間有利于孢子萌發(fā)；全黑暗最不利于孢子萌發(fā).

圖7 不同光照條件對白粉菌孢子萌發(fā)的影響Figure 7 The effect of different light conditions on spore germination of powdery mildew

3 討論

通過田間調查發(fā)現(xiàn)，隴西縣黃芪的白粉病一般6月下旬開始發(fā)病，在7月至9月上旬一直蔓延，9月中下旬減弱、趨緩，與周天旺等調查白粉病發(fā)生規(guī)律大致相同[6-8].

通過病原形態(tài)學觀察，將隴西縣黃芪白粉菌的病原菌鑒定為黃芪白粉菌(E.astragali).該病原形態(tài)特征與駱得功[6]等的研究結果基本一致.與楊春清等[9]和任舉等[10]報道的豌豆白粉菌(Erysiphepisi)形態(tài)不同，形態(tài)差異主要表現(xiàn)在豌豆白粉菌子囊果附屬絲頂端不分叉，附屬絲無色，上下近等粗，局部粗細不均.而黃芪束絲殼子囊果附屬絲頂端有1～2個分支，附屬絲褐色，全長近等粗.在觀察過程中，黃芪白粉菌子囊果附屬絲頂端分支較少，在劉鐵志[12]書籍中記載，附屬絲未見分支可能是附屬絲不成熟所致.

4 結論

形態(tài)學的分類受制于不同的生長階段，無法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類單位；分子生物學提供了一個更加敏感、精確、客觀的分子差別模型[22].為保證鑒定結果的準確性，對隴西縣黃芪白粉菌進行了分子生物學鑒定，進一步證實隴西縣黃芪的白粉菌為黃芪白粉菌(E.astragali).

本研究發(fā)現(xiàn)，在25℃、pH值6～8、全光照條件下，黃芪白粉菌分生孢子萌發(fā)率最高.在7月至9月上旬，當?shù)貧鉁赜欣诜稚咦用劝l(fā)，易導致白粉病大面積發(fā)生和蔓延.因此，在防治白粉病時，應選擇白粉病始發(fā)期開始防治.