短乳桿菌來源重組β-半乳糖苷酶初步分離純化與酶學特性研究

李 潔， 宮路路， 柳陳堅， 崔霖蕓， 張 寧

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校基礎教學部，貴州遵義563000； 2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500）

β-半乳糖苷酶，又稱乳糖酶，英文名稱βgalactosidase，簡寫為GAL，國際酶學委員會將其命名為 EC3.2.1.23［1］，為蛋白家族 GHF-2 類型.該酶能夠水解乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用來回收乳清中的乳糖，生產功能性食品添加劑［2］.利用其水解活性水解牛奶中的乳糖，制成低乳糖牛奶，抑或制成腸溶片作為藥物，治療乳糖不耐受癥［3］.利用其水解產物半乳糖作為供體，未分解的乳糖為受體，合成低聚半乳糖 GOS（galacto-oligosaccharide）［4］.由此可見，β -半乳糖苷酶在醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)上應用廣泛［5］.

自然界中，產生β-半乳糖苷酶的生物種類很多，廣泛存在于動物、植物、微生物［6］，尤其是微生物，如真菌、酵母菌、細菌.其中，研究較多的微生物有大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtils）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、乳桿菌（Lactobaills）、乳鏈球菌（Streptococcus lactis）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳酸克魯維酵母（Klyeromyces lactis）、乳酸脆壁酵母（Klyveromyces lacis fragilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Asperillus oryzae）等［7］.

鑒于產β-半乳糖苷酶的微生物來源豐富，本研究以此為啟發(fā)，以云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為原料，進行β-半乳糖苷酶乳酸菌篩選.在宋園亮等［8］的努力下，篩選得到一株產β-半乳糖苷酶乳酸菌，經16S rDNA鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）.結合分子克隆技術，將該菌來源β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中進行表達，得到一株產β-半乳糖苷酶重組大腸桿菌菌株，將其命名為 E.coli BL21／p ET28abgaB-18（以下簡稱18號菌株）.結合鎳柱分離技術對重組菌株表達的β-半乳糖苷酶進行分離，并對其酶學性質進行測定.

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗室保存的重組18號菌株.

1.1.2 試劑 卡納霉素（TaKaRa 公司）IPTG；聚丙烯酰胺，考馬斯亮藍R-250，溴酚藍，咪唑，NiSO4·6H2O（上海生工）；鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），ONP（Sigma公司）；碳酸鈉（天津試劑三廠），磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉（天津市風船化學試劑）.

1.1.3 儀器 恒溫搖床（上海智城分析儀器有限公司），超聲波細胞破碎儀（天翎儀器TL-650Y）高速離心機（SIGMA K 3-18），鎳柱（Qiagen），水平電泳儀（GENIUS），金屬浴（FUNAKOSHI），普通恒溫培養(yǎng)箱（NAPCO6500TC），紫外分光光度計（Genova）.

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶重組18號菌株誘導表達 吸取18號重組菌株20μL菌液接種至大腸桿菌培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基5 mL中，加入20μL卡那霉素溶液（質量濃度為100μg／mL）后混勻.恒溫搖床（溫度為37 ℃，轉速270 r／min）振蕩培養(yǎng)12 h.吸取4 mL 培養(yǎng)液，擴大接種至400 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，270 r／min 條件下培養(yǎng)，待菌體OD600達到0.6時，加入400 μL IPTG（200 mg／mL）誘導培養(yǎng)4 h.培養(yǎng)液于4℃，5 000 r／min離心10 min，棄上清液后加入磷酸鹽緩沖液（pH值為7.5）4 mL，置于冰水內超聲破碎，離心20 min（溫度4 ℃，轉速12 000 r／min）.收集上清液，沉淀，用磷酸鹽緩沖液懸浮待用.

1.2.2 β-半乳糖苷酶重組18號菌株蛋白純化 向經10 mmol／L PBS 平衡緩沖液（pH 7.4）處理的鎳柱內加入1.2.1中的上清液，用不同濃度咪唑的平衡緩沖液沖洗鎳柱，并收集；選擇合適的收集液待用.

1.2.3 重組β-半乳糖苷酶蛋白SDS-PAGE電泳 分別取未純化的細胞破碎液的上清液和沉淀，以及經鎳柱純化后的蛋白液各5μL，與5μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer混合，100℃煮沸10 min，13 000 r／min 離心 10 min；取離心上清液25μL進行SDS-PAGE電泳.

1.2.4 重組β-半乳糖苷酶酶活測定 β-半乳糖苷酶酶活單位定義為1 mL菌液產生的β-半乳糖苷酶在35℃、pH 7.5的條件下，每分鐘水解ONPG產生1μmol鄰硝基苯酚（ONP）所需要的酶量定義為一個酶活性單位，以U／mL表示.

反應體系為250μL重組β-半乳糖苷酶蛋白液，與等量體積ONPG溶液混勻，35℃恒溫孵育30 min，加入250 μL 碳酸鈉溶液終止反應［9］.檢測反應體系在OD420處的吸光度.每個反應體系平行測量3次（下同），并計算酶活.

1.2.5 重組β-半乳糖苷酶最適溫度和最適pH測定 將反應體系（詳見1.2.4，下同）分別在不同溫度（-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃）的水浴條件下進行酶促反應，結束后按照1.2.4進行檢測.

在最佳反應溫度下，將反應體系置于不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）［10］的緩沖液中進行酶促反應，結束后按照1.2.4進行檢測.

現(xiàn)在當?shù)剜l(xiāng)鎮(zhèn)派出所警力嚴重不足。由于基層警務需要承擔大量的人口管理事務，兩勞釋放人員、精神病人、重點信訪人員都屬于基層警務的職責內容。警察執(zhí)法在村莊社會中的重點是鄉(xiāng)村治安，解決糾紛只是派出所功能的一部分[37]。在“羊吃花生”案中，“青楞”故意制造糾紛以報復自己用水不得?！扒嗬恪鼻址傅膶ο笫谴謇锏拈T頭大戶，“青楞”知道現(xiàn)在不能用拳頭解決問題，于是才敢公然挑戰(zhàn)權威勢力。按理，“青楞”的行為應該受到制裁，但村干部的調解無法解決問題，而派出所嚴格依法辦事，也不再理會警務職責之外的鄉(xiāng)土利益訴求。

1.2.6 重組β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測定 將重組β-半乳糖苷酶置于不同溫度［11］（30、40、50、60、70、80 ℃）進行熱處理 2 h，結束后按照1.2.4 進行檢測.

將重組β-半乳糖苷酶置于pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的緩沖液中處理 1 h［12］，結束后按照 1.2.4 進行檢測.

1.2.7 金屬離子對重組β-半乳糖苷酶活性影響的測定 吸取重組β-半乳糖苷酶純化液25μL，依次加入225μL質量分數(shù)0.2%的CaCl2·2H2O、CuSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、Mg-SO4·7H2O、KCl、MnSO4、BaCl2和 ZnSO4等不同金屬離子溶液，加入250μL ONPG溶液誘導培養(yǎng)，以未處理酶液作為對照，依據(jù)1.2.5的測定結果，選定最適溫度、最適pH進行酶促反應，結束后按照1.2.4 進行檢測.

1.2.8 初步純化的重組 β-半乳糖苷酶 Km與Vmax測定 在35℃，pH 7.5條件下，測定不同濃度ONPG的酶促反應速率，根據(jù)米氏方程計算出β-半乳糖苷酶的Km和Vmax大小.

按照雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）將米氏方程改寫為

根據(jù)酶活標準曲線計算不同［S］對應V，求出二者倒數(shù)，以1／V對1／［S］作圖繪制直線.橫軸截距為 x＝-1／Km，得 Km＝-1／x；縱軸截距為 y＝1／Vmax，得Vmax＝1／y，并計算出β-半乳糖苷酶Km和Vmax大小.

2 結果與討論

2.1 重組β-半乳糖苷酶酶活測定在測定1.2.2中分離得到的重組β-半乳糖苷酶活性時發(fā)現(xiàn)，當按照1.2.4方法進行酶促反應時，吸取鎳柱分離得到的重組β-半乳糖苷酶蛋白液250μL加入到含等量體積ONPG溶液的反應容器中，溶液立即變成黃色（黃色為反應產物ONP的顏色，反應前無色）.由于酶促反應時間很短，難以計算反應時間.其原因是酶濃度過高，反應進程過快，影響酶促反應速率測定，需探索重組蛋白的反應濃度.按照稀釋倍數(shù) 45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 進行稀釋，其結果如圖1所示，在低于45倍濃度進行稀釋時，稀釋后的酶液與底物反應很快，很難把握酶促反應時間；繼續(xù)加大稀釋倍數(shù)，酶促反應速率逐步平緩下降.本實驗選擇稀釋100倍（稀釋便捷，反應時間可控，可檢測性強）酶液參與酶促反應測定.

圖1 酶促反應稀釋倍數(shù)測定Fig.1 Determination of dilution multiple of enzymatic reaction

將酶液稀釋100倍后，測定酶活，再換算成每1 mL重組大腸桿菌菌液酶活，得到重組β-半乳糖苷酶酶活為16.5 U／mL，即每1 mL重組大腸桿菌菌液的酶活為16.5 U.

2.2 重組β-半乳糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜將1.2.2中純化酶液進行SDS-PAGE電泳，其結果如圖2所示.在泳道1中，66.2和35 kDa處有清晰蛋白條帶，推測為重組β-半乳糖苷酶的2個亞基，電泳圖譜中亦有雜蛋白條帶.因此，該方法只能對重組蛋白進行初步分離純化.

圖2 重組菌株18號菌株SDS-PAGEFig.2 The SDS-PAGE figure of recombinant strain No.18

圖3中，泳道1為重組菌株細胞裂解液上清液，在上清液中很難判斷重組蛋白條帶；泳道2為細胞裂解液沉淀，在細胞裂解液沉淀中可發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達（圖3中大、小亞基所示）.由此可見，重組蛋白主要出現(xiàn)在細胞裂解液沉淀中，結合圖2，則說明上清液中有重組蛋白，但與沉淀中蛋白量相比較少，蛋白主要在沉淀中，因此，該蛋白主要以包涵體形式存在于細胞中.

圖3 18號菌株由來胞內蛋白電泳結果Fig.3 Results of intracellular protein electrophoresis of strain No.18

2.3 重組β-半乳糖苷酶最適反應溫度和最適pH將β-半乳糖苷酶與ONPG混勻后置于不同溫度條件下進行反應，待結束后測定其OD420的吸光度，繪制相對酶活曲線如圖4（為便于數(shù)據(jù)處理，以下作圖均按照相對酶活繪制）.可以看出，溫度在0～35℃變化時，隨著溫度升高，相對酶促反應速率逐漸加快，35℃時達到最大.因此，得到其最適溫度為35℃.隨著反應體系溫度升高，相對酶促反應速率逐漸下降：在35～50℃時，相對酶促反應速率下降緩慢；在50～85℃時，相對酶促反應速率下降明顯；大于85℃時，相對酶促反應速率接近于0，推測酶在此時處于失活狀態(tài).

圖4 Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶最適反應溫度Fig.4 The optimum temperature ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

將β-半乳糖苷酶與底物混勻后置于不同pH緩沖溶液中進行酶促反應，待結束后測定其OD420的吸光度，并探討pH對該酶活性影響.根據(jù)實驗測定結果，繪制相對酶活曲線如圖5（以最大反應速率做參考）.可以看出，pH值為0～5.0時，相對酶促反應接近于0；pH值為5.0～6.5時，相對酶促反應速率迅速上升；pH值為6.5～8.0時，相對酶促反應速率比較穩(wěn)定；pH值為7.5時，相對酶促反應速率達到最大，得到該酶最適pH值為7.5.當溶液pH值大于8.0時，相對酶促反應速率急劇下降；pH值為8.5～10.5的范圍內，相對酶促反應速率接近于0，推測酶在此時處于失活狀態(tài).

圖5 Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶最適pHFig.5 The optimum p H ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.4 重組β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性將β-半乳糖苷酶與底物混勻后，置于不同溫度條件下孵育2 h，在最佳反應條件下（35℃，pH 7.5）進行酶促反應，并測定其OD420的吸光度，繪制相對酶活曲線如圖6.可以看出：在溫度30～50℃范圍內，酶穩(wěn)定性較好；當溫度升高到60℃以上時，相對酶活性急劇下降.推測酶在較高溫度下空間結構遭到破壞，影響了酶促反應.因此，該酶在30～50℃范圍內能夠保持很好的熱穩(wěn)定性，較高溫度條件下極易失活，屬于常溫酶.

圖6 Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

將該酶置于不同pH緩沖液中孵育1 h，隨后將其置于最佳反應條件下反應，并測定其OD420的吸光度，繪制相對酶活曲線，探討不同pH條件下酶促反應速率，如圖7所示.結果表明：酶在pH值小于4.0的范圍內，相對酶活接近于0，說明其穩(wěn)定性很差；pH值為4.0～8.0時，酶穩(wěn)定性逐漸增加；當酶處在pH值為8.0以上溶液中，其穩(wěn)定性很快下降；pH值大于11時，相對酶活趨近于0，推測其結構遭到破壞而失活.由此可見，該酶在pH 6.0～8.0范圍內具有較好的pH穩(wěn)定性.

圖7 Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性Fig.7 The p H stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.5 金屬離子對重組β-半乳糖苷酶活性影響將該酶與不同金屬離子醋酸鹽緩沖液（pH 7.5）混勻，測定不同金屬離子對酶促反應速率的影響，結果見表1.

表1 金屬離子對Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶活性的影響Tab.1 Effects onβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3 by different irons

可以看出，在加入金屬離子 Mg2＋、Mn2＋的反應體系中，與未添加金屬離子對照組相比，重組β-半乳糖苷酶具有很好的催化活性，推測 Mg2＋、Mn2＋能夠促進酶促反應；在加入金屬離子Cu2＋、Ba2＋與K＋的反應體系中，重組β-半乳糖苷酶與未添加金屬離子對照組相比，酶促反應速率都有所下降；Cu2＋存在時酶活性下降至三分之一，明顯抑制了酶促反應；Ba2＋與K＋存在時，酶促反應速率也有一定下降.由此可見，Mg2＋、Mn2＋能夠很好促進酶促反應，是該酶的激活劑；Cu2＋、Ba2＋與 K＋影響了酶促反應，具有一定抑制作用，為該酶反應抑制劑；其他金屬離子對酶促反應影響不大.

2.6 重組β-半乳糖苷酶 K m與 V max將重組β-半乳糖苷酶與一系列不同濃度ONPG溶液（2、4、8、10、16、20 mmol／L）均勻混合，在最適條件下進行酶促反應，分別測定不同ONPG濃度下的酶活性，并繪制出1／V 對 1／［S］直線，如圖8.通過計算得到Km＝0.816 mmol／L，Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.

圖8 Lb.brevis GJ1-3來源β-半乳糖苷酶的動力學結果Fig.8 The kineties ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

3 結束語

本研究將β-半乳糖苷酶重組18號菌株在IPTG的誘導下進行表達.表達蛋白經處理后分別進行SDS-PAGE電泳，結果如圖2和圖3.在圖2中，第1泳道內有2個蛋白條帶，其相對分子質量在 66.2 和35 kDa 附近.結合 Pridmore［6］等報道的短乳桿菌全基因組序列，以及其編碼的β-半乳糖苷酶基因序列，利用DNAMAN軟件預測β-半乳糖苷酶的結構發(fā)現(xiàn)，該酶有2個大小亞基構成：編碼大亞基的核苷酸序列大小為1 887 bp，其編碼的蛋白質亞基大小為71.6 kDa；編碼小亞基的核苷酸序列大小為966 bp，其編碼的蛋白質亞基大小為34.5 kDa.圖2中蛋白條帶大致在這個數(shù)值附近，然其位置不是很理想，需進一步探討.除此之外，亦有雜蛋白出現(xiàn)，說明鎳柱親和分離效果不理想.在圖3中，有2個表達量很大的蛋白，上清液中目的條帶不明顯.利用上清以及上清蛋白純化液進行酶促反應時發(fā)現(xiàn)，加入酶液，反應變色，且反應瞬間結束，說明酶濃度高，底物相對較少，說明反應體系中有重組酶存在，且濃度很高，因此，需稀釋酶液.由此可見，18號菌株表達的重組β-半乳糖苷酶主要以包涵體形式存在于細胞內，僅有部分酶蛋白存在于細胞裂解上清液中，需進一步優(yōu)化重組菌株培養(yǎng)條件，改善其酶分泌情況.

重組β-半乳糖苷酶最適溫度為37℃，屬于常溫酶，在30～50℃范圍內熱穩(wěn)定性良好，50℃時能夠保留90%的相對酶活；60℃時相對酶活降低到10%以下.潘渠等［14］研究嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶異源性表達時發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶在60℃時仍能保持一半活性.說明溫度對該酶活性影響較大，較高溫度便會引起酶變性失活.重組酶最適pH值為7.5，在 pH 6.0～8.0范圍內，穩(wěn)定性較好；pH 6.0時，相對酶活降到10%以下；當pH值增加到10.0時，酶仍保留50%相對酶活.說明該酶對酸比較敏感，對堿適應能力較強.與聶春明［10］研究相比，酶的 pH適應范圍較廣.Mg2＋、Mn2＋對該酶活性有一定促進作用，其中Mg2＋促進作用較好，為酶的激活劑，Cu2＋為其抑制劑.Chanalia 等［13］在研究乳酸片球菌來源的β-半乳糖苷酶活性時發(fā)現(xiàn)，Ca2＋、Mg2＋和 Mn2＋對該酶具有活化作用.Wutor等［15］研究發(fā)現(xiàn) Cu2＋也是該酶的抑制劑.聶春明［10］研究金屬離子對乳酸桿菌來源重組β-半乳糖苷酶時發(fā)現(xiàn)，Mg2＋具有很好促進作用，高濃度金屬離子會抑制β-半乳糖苷酶活性.宋園亮等［8］研究短乳桿菌β-半乳糖苷酶性質時發(fā)現(xiàn)，Mg2＋、K＋能夠促進酶活性，Ba2＋和 Cu2＋抑制酶活性.說明Mg2＋為其激活劑，Cu2＋為抑制劑.潘渠等［14］將嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中進行了表達，測得重組菌株β-半乳糖苷酶的 Km＝2.18 mmol／L，Vmax＝273 mmol／（L·min）.在本研究中，經試驗測得該重組β-半乳糖苷酶特征性常數(shù)Km＝0.816 mmol／L，最大反應速率 Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.從 Km大小對比發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌來源重組β-半乳糖苷酶與底物ONPG具有很好的親和力，然而最大反應速率不是很高.酶經鎳柱純化后，酶蛋白基本達到電泳純，但雜蛋白仍然存在.接下來將通過不同分離純化技術，對酶液進行進一步分離提純，獲得更多關于短乳桿菌來源β-半乳糖苷酶的性質，為其工業(yè)化應用以及科學研究提供更為詳盡的理論參考.