頭孢菌素C的生物合成及其調(diào)控

劉 鋼

（1.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

二十世紀(jì)四十年代Guiseppi Brotzu教授從意大利加利利群島海水中分離到了一株可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)-青霉素N的絲狀真菌，并命名為頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium，后被命名為Acremonium chrysogenum）［1］.頂頭孢霉屬半知菌亞門(mén)、叢梗孢目、叢梗孢科、頭孢霉屬，至今未發(fā)現(xiàn)其有性階段［2］.后來(lái)發(fā)現(xiàn)該株菌還能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同于青霉素的 β-內(nèi)酰胺類(lèi)化合物.1961年，Hodgkin等［3］通過(guò)X射線確定了該化合物的結(jié)構(gòu)，并命名為頭孢菌素C（cephalosporin，CPC），其結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)與二氫噻嗪環(huán)形成的駢環(huán)結(jié)構(gòu).頭孢菌素C能夠通過(guò)影響細(xì)胞壁主要成分肽聚糖鏈的組裝和合成，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁形成而發(fā)揮抗菌作用.由于廣譜的抗菌能力及對(duì)人、畜相對(duì)安全的特性，頭孢類(lèi)抗生素被廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，成為臨床上最重要的抗感染藥物［4］.頭孢菌素C與青霉素同屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，具有相似的抑菌活性.但是與青霉素一樣，頭孢菌素C也存在抗菌譜窄和容易被青霉素酶降解的弊端.為解決這一問(wèn)題，人們通過(guò)化學(xué)催化或酶解法去除頭孢菌素C的側(cè)鏈基團(tuán)形成中間體7-氨基頭孢烷酸（7-ACA），然后利用7-ACA半合成一系列頭孢類(lèi)抗生素［5］.

1 頭孢菌素C及頭孢類(lèi)抗生素

頭孢菌素C結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)與二氫噻嗪環(huán)形成的駢環(huán)結(jié)構(gòu)［3］.通過(guò)化學(xué)催化或酶促反應(yīng)的方式去除CPC的側(cè)鏈基團(tuán)，即形成7-氨基頭孢烷酸（7-ACA），7-ACA是合成頭孢類(lèi)抗生素的中間體.也可以從青霉素G出發(fā)，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最后生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）.在此基礎(chǔ)上，再通過(guò)半化學(xué)合成和酶法合成一系列頭孢類(lèi)衍生物（圖1）.到目前為止，第五代頭孢類(lèi)抗生素已經(jīng)問(wèn)世［6］.

第一代頭孢類(lèi)抗生素多為耐青霉素酶的半廣譜抗生素，包括頭孢唑啉（先鋒霉素V）、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐和頭孢硫脒，主要作用于好氧革蘭氏陽(yáng)性（G＋）球菌，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性（G-）菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶的抵抗能力較弱，僅對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、奇異變形球菌（Proteus mirabilis）、流感桿菌（Himophilus influenzae）、傷寒桿菌（Salmonella typhi）和痢疾桿菌（Shigella castellani）表現(xiàn)出抗菌活性.其中，頭孢唑啉對(duì)G＋菌的作用較強(qiáng)，常作為外科手術(shù)預(yù)防用藥.第二代頭孢類(lèi)抗生素包括頭孢呋辛、頭孢替安、頭孢克洛和頭孢丙烯等，抗菌譜廣，抗β-內(nèi)酰胺酶水解性能增強(qiáng)，對(duì)奈瑟菌（Neisseria）、吲哚陽(yáng)性變形桿菌、檸檬酸桿菌（Citrobacter）以及腸桿菌（Enterobacteria）具有一定抗菌活性.第三代頭孢類(lèi)抗生素包括頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢克肟和頭孢地尼等，具有廣譜抑菌活性，其抗G-菌活性進(jìn)一步增強(qiáng)（如抗菌譜覆蓋銅綠假單胞菌等），但對(duì)G＋菌作用不及第一、二代頭孢類(lèi)抗生素，基本無(wú)腎毒性.第四代頭孢類(lèi)抗生素包括頭孢吡肟、頭孢唑蘭、頭孢噻利和頭孢匹羅，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶水解具有高度耐受性，抗菌譜更為廣泛，對(duì)青霉素結(jié)合蛋白具有高度親和性，抗G＋菌活性與頭孢曲松相似，抗G-菌活性與頭孢他啶相似，但對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）穩(wěn)定性稍差，無(wú)腎毒性，對(duì)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）等具有很強(qiáng)的抑制活性，用于治療多種細(xì)菌的混合感染或多重耐藥菌感染引起的疾病.第五代頭孢類(lèi)抗生素包括頭孢洛林和頭孢吡普，抗菌譜、抗菌活性以及抗β-內(nèi)酰胺酶水解性能方面都優(yōu)于前四代產(chǎn)品，抗G＋菌活性與頭孢曲松相似，抗G-菌活性（包括銅綠假單胞菌）與頭孢他啶相似，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌等超級(jí)耐藥菌具有抗菌活性，但對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）穩(wěn)定性稍差，無(wú)腎毒性.

圖1 頭孢類(lèi)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of cephalosporin C and its derivatives

2 頭孢菌素C的生物合成

幾十年的研究已基本闡明頭孢菌素C生物合成途徑中關(guān)鍵基因及其編碼產(chǎn)物參與的酶催化反應(yīng)等內(nèi)容［7］.同大多數(shù)來(lái)源于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物一樣，頭孢菌素的生物合成基因成簇存在于頂頭孢霉的染色體上.在頂頭孢霉C10菌株中，參與頭孢菌素生物合成的基因分別存在于VII號(hào)和I號(hào)染色體上的2個(gè)簇中，被稱為“早期”基因簇和“晚期”基因簇.“早期”基因簇包括 pcbAB-pcbC和cefD1-cefD2，“晚期”基因簇由cefEF和cefG組成（圖2）.正是在這些基因編碼的產(chǎn)物作用下，將初級(jí)代謝產(chǎn)物氨基酸通過(guò)有序的縮合和后修飾，最終形成具有生物活性的頭孢菌素C.

圖2 頭孢菌素生物合成基因及其分布Fig.2 Organization of the cephalosporin biosynthetic genes

2.1 參與頭孢菌素C合成的前體物同青霉素一樣，頭孢菌素C屬于典型的非核糖體肽類(lèi)化合物，參與其合成的前體包括L-α-氨基己二酸（L-α-AAA）、L-半胱氨酸和L-纈氨酸.L-半胱氨酸和L-纈氨酸都是參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸，而L-α-AAA則是合成L-賴氨酸的中間代謝產(chǎn)物.

不同于細(xì)菌，真菌中的L-α-AAA是由α-酮戊二酸與乙酰輔酶A縮合，并經(jīng)過(guò)高檸檬酸-同型烏頭酸-高異檸檬酸-酮己二酸途徑形成，是形成L-賴氨酸的中間代謝產(chǎn)物.研究表明，頂頭孢霉細(xì)胞內(nèi)L-α-AAA的濃度與頭孢菌素C的產(chǎn)量直接相關(guān).然而，培養(yǎng)基中添加高濃度的L-賴氨酸卻抑制了頭孢菌素C的產(chǎn)生，推測(cè)高濃度的L-賴氨酸反饋抑制了高檸檬酸合成酶（Homocitrate Synthase）的形成，從而抑制 L-α-AAA的合成［8］.此外，L-α -AAA 在還原酶作用下，經(jīng)過(guò)a-氨基己二酸半醛-酵母氨酸途徑，最終形成L-賴氨酸.由lys2基因編碼的L-α-AAA還原酶活性依賴于NADPH的存在.在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)菌體處于生長(zhǎng)期時(shí)，L-α-AAA還原酶的活性最高，而當(dāng)頭孢菌素C開(kāi)始產(chǎn)生時(shí)，L-α-AAA還原酶的活性大幅降低.另外，在頭孢菌素C高產(chǎn)菌株中，L-α-AAA還原酶的活性較低，推測(cè)當(dāng)L-α-AAA還原酶的活性降低時(shí)，會(huì)積累更多的L-α-AAA，從而使得頭孢菌素C產(chǎn)量升高.

參與頭孢菌素合成的另外一個(gè)主要前體物是L-半胱氨酸，發(fā)酵過(guò)程中L-半胱氨酸的產(chǎn)生也是頭孢菌素合成的一個(gè)主要限速步驟.研究發(fā)現(xiàn)在頂頭孢霉中存在4種L-半胱氨酸的合成途徑，分別是無(wú)機(jī)硫酸鹽的同化途徑、由O-乙酰-L-絲氨酸直接合成途徑，通過(guò)轉(zhuǎn)硫途徑形成O-乙酰同型絲氨酸進(jìn)而合成L-半胱氨酸途徑，以及反轉(zhuǎn)硫途徑中通過(guò)甲硫氨酸來(lái)形成L-半胱氨酸的合成途徑［9-10］.研究表明，包括頂頭孢霉在內(nèi)的一些絲狀真菌會(huì)優(yōu)先利用來(lái)自于反轉(zhuǎn)硫途徑中合成的L-半胱氨酸，而不是直接利用來(lái)自于無(wú)機(jī)硫酸鹽的L-半胱氨酸［11］.

L-纈氨酸也是頭孢菌素合成中的一個(gè)重要組成部分，它與亮氨酸和異亮氨酸一起統(tǒng)稱為支鏈氨基酸.L-纈氨酸由丙酮酸經(jīng)4步反應(yīng)催化而來(lái).在頂頭孢霉中，高濃度的L-纈氨酸會(huì)反饋抑制參與L-纈氨酸合成過(guò)程第一步反應(yīng)的乙酰羥酸合酶（Acetohydroxy acid synthase）活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)L-纈氨酸的含量降低［12］.

2.2 頭孢菌素C的生物合成途徑頭孢菌素是典型的非核糖體肽類(lèi)化合物，研究證明頭孢菌素C的生物合成途徑共存在5步酶促反應(yīng)［7］：1）L-α-AAA和L-半胱氨酸在pcbAB編碼的ACV合酶（ACVS）催化下，縮合為L(zhǎng)-α-AAA-L-半胱氨酸（AC），L-纈氨酸被異構(gòu)化為D-纈氨酸后與上述二肽縮合形成δ-（L-α-氨基己二酰）-（L-半胱氨酰）-D-纈氨酸（簡(jiǎn)稱ACV）.相對(duì)于其它結(jié)構(gòu)基因，pcbAB基因的轉(zhuǎn)錄水平較低，因此該步反應(yīng)是頭孢菌素C生物合成過(guò)程中的限速步驟.2）三肽ACV在pcbC編碼的異青霉素N合酶（IPNS）催化下依次形成β-內(nèi)酰胺環(huán)和五元噻唑環(huán)，最終生成異青霉素N（IPN），該反應(yīng)效率明顯受到Fe2＋和還原劑（如抗壞血酸和DTT等）的促進(jìn).雖然IPNS并不具有嚴(yán)格的底物特異性，但對(duì)ACV以外的底物催化效率極低.3）在cefD1和cefD2編碼的乙酰輔酶A合酶和乙酰輔酶A消旋酶的作用下，IPN被催化生成青霉素N（PenN）.4）cefEF編碼的脫乙酰氧基頭孢菌素合酶（DAOC-synthetase）和脫乙酰基頭孢菌素合酶（DAC-synthetase）參與了形成六元噻嗪環(huán)的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)和C3位的羥基化和氧化反應(yīng)，負(fù)責(zé)將 PenN催化為脫乙酰頭孢菌素C（DAC）.該步反應(yīng)依賴于 Fe2＋、氧原子、α - 酮戊二酸以及抗壞血酸等的存在.5）最后，DAC在cefG編碼的脫乙酰頭孢菌素C酰基轉(zhuǎn)移酶（DAC-acyltransferase）的作用下加入乙?；深^孢菌素C（圖3）.

圖3 頭孢菌素C的生物合成Fig.3 The biosynthesis of cephalosporin C

2.3 頭孢菌素C及其中間代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)催化頭孢菌素生物合成的酶，在細(xì)胞內(nèi)有各自的定位，如ACV合酶與IPN合酶定位于細(xì)胞質(zhì)，而乙酰輔酶A合酶和乙酰輔酶A消旋酶（CefD1和CefD2）則定位于過(guò)氧化物酶體［13］.暗示頭孢菌素生物合成過(guò)程發(fā)生在不同的細(xì)胞區(qū)間，可能存在代謝物以及代謝中間產(chǎn)物的多次跨膜運(yùn)輸.近期研究發(fā)現(xiàn)在“早期”基因簇pcbAB基因的下游存在一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因cefP，cefP基因編碼的產(chǎn)物具有11個(gè)跨膜區(qū)，推測(cè)此蛋白主要參與了IPN向過(guò)氧化物酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程.敲除cefP后完全阻斷了頭孢菌素C的產(chǎn)生，同時(shí)積累了大量的 IPN［14］.在 cefD1基因下游存在另外一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因cefM，其編碼的蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū)，可能參與了PenN從過(guò)氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)的過(guò)程.有研究表明，在頂頭孢霉中敲除cefM后，細(xì)胞內(nèi)積累了大量的PenN，同時(shí)，頭孢菌素 C 的產(chǎn)量大幅降低［15］.另外，在“早期”基因簇中pcbAB基因的下游存在另一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因cefT，該基因編碼一個(gè)定位于細(xì)胞膜上的MFS家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能負(fù)責(zé)IPN、PenN和DAC向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn).研究發(fā)現(xiàn)，cefT基因的拷貝數(shù)與頭孢菌素C的產(chǎn)量呈正相關(guān)性，增加cefT的拷貝數(shù)后，頭孢菌素C的產(chǎn)量得到顯著提高［16］.

3 頭孢菌素C生物合成的調(diào)控

為了提高頭孢菌素C的產(chǎn)量，促進(jìn)其工業(yè)化生產(chǎn)，頭孢菌素C生物合成的調(diào)控及其分子基礎(chǔ)研究受到了廣泛的關(guān)注［7，12］.研究表明，碳氮源、氨基酸、磷酸鹽、氧及其它一些調(diào)控因子對(duì)頭孢菌素C的生物合成有著顯著的影響［4］.此外，頭孢菌素C的產(chǎn)生還與形態(tài)分化有著密切的聯(lián)系［17］.

3.1 碳源對(duì)頭孢菌素生物合成的調(diào)控碳源是影響頂頭孢霉中頭孢菌素C合成的重要因素之一.當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的含量達(dá)到6.3%時(shí)，頭孢菌素C的產(chǎn)量就會(huì)顯著下降［18］.在頂頭孢霉野生型菌株（ATCC 14553）和工業(yè)生產(chǎn)菌株（A3／2）中添加葡萄糖等速效碳源，可以強(qiáng)烈抑制基因pcbC和cefEF的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致頭孢菌素C的產(chǎn)量降低近5倍.雖然葡萄糖對(duì)純化的異青霉素N合成酶沒(méi)有抑制作用，但其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的3-磷酸甘油醛則對(duì) ACV合成酶具有抑制效應(yīng)［19］.在頂頭孢霉中，速效利用碳源雖然有利于絲狀真菌生長(zhǎng)，但對(duì)頭孢菌素C的合成卻具有明顯的抑制效應(yīng)，而緩速利用碳源則有利于頭孢菌素C的產(chǎn)生.按照有利于頭孢菌素C產(chǎn)生的碳源排序，依次是蔗糖、半乳糖、果糖、麥芽糖和葡萄糖.因此，在化學(xué)合成培養(yǎng)基中，往往添加27 g／L的葡萄糖以供真菌生長(zhǎng)，添加36 g／L的蔗糖用于頭孢菌素C產(chǎn)生.研究表明，速效利用碳源不僅對(duì)抗生素合成酶具有抑制作用，同時(shí)還會(huì)引起這些合成酶的降解，此外，速效利用碳源明顯不利于參與由PenN到頭孢菌素C合成過(guò)程關(guān)鍵基因的表達(dá).在葡萄糖等速效利用碳源存在的情況下，pcbC和cefEF基因的轉(zhuǎn)錄明顯受到抑制［20］.進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示頂頭孢霉中存在一種葡萄糖依賴型的抑制蛋白CRE1，由基因cre1編碼.CRE1是酵母中MIG1的同源蛋白，同時(shí)也是一個(gè)自調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子.CRE1可以有效地結(jié)合在基因pcbC和 cefEF的啟動(dòng)子區(qū)，從而抑制他們的轉(zhuǎn)錄［21］.

3.2 氮源對(duì)頭孢菌素生物合成的調(diào)控在頂頭孢霉發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)氨鹽（NH4）2SO4大于100 mM時(shí)，頭孢菌素C的產(chǎn)生明顯受到抑制，而添加L-天冬酰胺和L-精氨酸作為氮源則有利于頭孢菌素C的產(chǎn)生［22］.最近我們課題組的研究表明至少有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（AcAREA和AcAREB）參與了頂頭孢霉中氮源對(duì)頭孢菌素生物合成的調(diào)控［23-24］.AcareA基因編碼一個(gè)由960個(gè)氨基酸組成的含有Cys2／Cys2鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，該基因的缺失導(dǎo)致頂頭孢霉無(wú)法利用和尿酸，并且在含有低濃度的NH4＋、谷氨酰胺和尿素的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中頭孢菌素C產(chǎn)量明顯下降.研究表明在以為唯一氮源的培養(yǎng)基中，AcAREA通過(guò)分別結(jié)合硝酸還原酶基因niaD和亞硝酸還原酶基因niiA的啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)激活它們的轉(zhuǎn)錄.進(jìn)一步研究揭示，AcAREA是通過(guò)直接調(diào)節(jié)pcbAB的轉(zhuǎn)錄并間接影響cefD2、cefEF和cefG的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控頭孢菌素C的生物合成.AcareB編碼一個(gè)具有GATA鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，與野生型相比，AcareB突變株中頭孢菌素生物合成基因轉(zhuǎn)錄量顯著下降，頭孢菌素C產(chǎn)量明顯降低.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示AcAREB能夠結(jié)合到pcbAB-pcbC、cefD1-cefD2和cefEF-cefG的雙向啟動(dòng)子區(qū)，從而調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄.此外，AcareA能夠正調(diào)節(jié)AcareB的轉(zhuǎn)錄，AcAREA和AcAREB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合pcbAB-pcbC的啟動(dòng)子區(qū).這些結(jié)果暗示AcAREA和AcAREB存在相互作用，他們?cè)陧旑^孢霉中協(xié)同調(diào)控頭孢菌素C的產(chǎn)生.

3.3 甲硫氨酸對(duì)頭孢菌素生物合成的調(diào)控在工業(yè)生產(chǎn)中，甲硫氨酸一直作為頭孢菌素C產(chǎn)生的促進(jìn)劑而被廣泛使用［25］.除了添加 L-型甲硫氨酸外，D-型或者DL-型甲硫氨酸的添加也可以刺激頭孢菌素C的生成，其中DL-型的甲硫氨酸效果最好.甲硫氨酸的添加也可以促進(jìn)PenN的產(chǎn)生.對(duì)PenN或者頭孢菌素C來(lái)說(shuō)，甲硫氨酸雖然不是其前體物，但卻可以為其生物合成提供有效的硫原子［26］.然而，后來(lái)發(fā)現(xiàn)添加甲硫氨酸的非硫同系物正亮氨酸時(shí)，也可以促進(jìn)頭孢菌素C的合成，所以推測(cè)甲硫氨酸并不是通過(guò)提供硫原子促進(jìn)頭孢菌素C的合成［27］.此外，只有在頂頭孢霉快速生長(zhǎng)期添加甲硫氨酸時(shí)，才會(huì)促進(jìn)頭孢菌素C的合成，此時(shí)頂頭孢霉自身內(nèi)源性的甲硫氨酸濃度也會(huì)瞬時(shí)增加2～3倍，說(shuō)明內(nèi)源性的甲硫氨酸或者大量的外源性的甲硫氨酸對(duì)頭孢菌素C的生物合成起到了的一定的調(diào)控作用［9］.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸可以影響包括ACVS、環(huán)化酶和擴(kuò)環(huán)酶的表達(dá)，在添加甲硫氨酸時(shí)，參與頭孢菌素合成相關(guān)基因pcb-AB、pcbC和cefEF的轉(zhuǎn)錄量明顯提高［28］，說(shuō)明甲硫氨酸可以通過(guò)促進(jìn)合成基因的表達(dá)來(lái)提高頭孢菌素C的產(chǎn)量.

早期的研究發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)硫途徑中胱硫醚-γ-裂解酶負(fù)責(zé)胱硫醚轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，推測(cè)頂頭孢霉依賴于該途徑為頭孢菌素C的合成提供其前體物半胱氨酸［29］.在體內(nèi)，高表達(dá)胱硫醚-γ-裂解酶的編碼基因mecB促使頭孢菌素C產(chǎn)量增加10%～40%［30］.在含甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，mecB的敲除并沒(méi)有顯著影響參與頭孢菌素C合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而在不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，菌體均能正常生長(zhǎng)且頭孢菌素C產(chǎn)量不下降［31］，說(shuō)明在頂頭孢霉中甲硫氨酸不是通過(guò)胱硫醚-γ-裂解酶來(lái)調(diào)控頭孢菌素C的生成.最近我們課題組研究發(fā)現(xiàn)，頂頭孢霉中甲硫氨酸是通過(guò)形成腺苷甲硫氨酸（SAM）促進(jìn)頭孢菌素C的合成.通過(guò)對(duì)頂頭孢霉甲硫氨酸代謝途徑的定向改造，包括高表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因AcsamS及胱硫醚-γ-裂解酶編碼基因mecB，篩選并敲除腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Acppm1，首次構(gòu)建了不依賴甲硫氨酸卻能促進(jìn)頭孢菌素C產(chǎn)量的基因工程菌株［32］.

3.4 細(xì)胞自噬對(duì)頭孢菌素生物合成的調(diào)控自噬是真核生物中依賴于溶酶體或者液泡的一種降解途徑，主要參與降解細(xì)胞內(nèi)冗余或者異常的蛋白以及細(xì)胞器等，幫助細(xì)胞維持正常的生理功能［33］.在自然狀態(tài)及工業(yè)發(fā)酵中，當(dāng)真菌持續(xù)面臨營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，很可能是通過(guò)發(fā)生自噬來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)及分化［34］.近年來(lái)，我們課題組對(duì)頂頭孢霉中部分自噬相關(guān)基因的功能進(jìn)行了初步研究.Acatg1編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，參與頂頭孢霉自噬的誘導(dǎo).Acatg1基因敲除突變株表現(xiàn)出生長(zhǎng)減弱，但頭孢菌素C的產(chǎn)量明顯增加，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在該突變株中異青霉素N合酶（IPNS）積累，推測(cè)阻斷自噬導(dǎo)致該蛋白降解減弱，從而增強(qiáng)了頭孢菌素C的合成［35］.Acatg8編碼自噬核心蛋白，Acatg8的缺失也顯著促進(jìn)了頂頭孢霉中頭孢菌素C的產(chǎn)生，但是該基因缺失同時(shí)也導(dǎo)致發(fā)酵后期菌體死亡加快.將受木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的Acatg8導(dǎo)入突變株中后，獲得了基因工程菌株.在木糖存在的條件下，該菌株中Acatg8基因能夠正常表達(dá)，菌體死亡減緩，而頭孢菌素C產(chǎn)量顯著高于野生株［36］.Acatg12的缺失使頭孢菌素C的產(chǎn)量增加了3倍，但發(fā)酵后期菌體死亡率并沒(méi)有顯著增加［37］.并不是所有的自噬相關(guān)基因的缺失都會(huì)促進(jìn)頭孢菌素C的產(chǎn)生.Acatg11的缺失并沒(méi)有增加頭孢菌素C的產(chǎn)量，相反還略為下降［38］.可以看出，不同的自噬相關(guān)基因?qū)︻^孢菌素C產(chǎn)生的影響存在很大差異，具體的機(jī)制仍需要深入研究.

3.5 頭孢菌素生物合成過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與生物合成基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來(lái)促進(jìn)或抑制該基因轉(zhuǎn)錄.轉(zhuǎn)錄因子分為全局性調(diào)控因子（如 PacC、NRE、AnCF、LaeA、VeA等）和途徑特異性調(diào)控因子.PacC是一種pH依賴性的鋅指蛋白，正調(diào)控頭孢菌素C的合成.在堿性條件下，PacC由蛋白酶去除其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域后由閉合狀態(tài)變成開(kāi)放狀態(tài)，從而被激活，進(jìn)入細(xì)胞核后PacC與pcbAB-pcbC間啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，促進(jìn)pcbAB和 pcbC的轉(zhuǎn)錄［39］.LaeA與多效調(diào)控因子VeA及VeB形成復(fù)合物，共同協(xié)調(diào)光照刺激來(lái)調(diào)控頭孢菌素C的產(chǎn)生以及菌絲分化過(guò)程.頂頭孢霉多效調(diào)控因子AcVeA能調(diào)控頭孢菌素C生物合成基因（pcbAB、pcbC、cefD1、cefD2、cefEF 與cefG）的轉(zhuǎn)錄水平，敲除 AcveA導(dǎo)致頭孢菌素 C產(chǎn)量大幅度降低［40］.

CPCR1（Cephalosporin C Regulator 1）是頂頭孢霉的轉(zhuǎn)錄激活因子，能結(jié)合在pcbC啟動(dòng)子區(qū)［41］.Schmitt等［42］隨后通過(guò)酵母雙雜交策略鑒定得到一個(gè)能夠與CPCR1互作的蛋白—AcFKH1.AcFKH1含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為負(fù)責(zé)蛋白磷酸化的N端FHA結(jié)構(gòu)域（forkhead-associated domain）以及與DNA結(jié)合 的C端的FKH結(jié)構(gòu)域.AcFKH1對(duì)CPCR1發(fā)揮功能是必需的，同時(shí)AcFKH1還能夠與pcbAB-pcbC啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合.此外，研究發(fā)現(xiàn)CPCR1參與調(diào)控頂頭孢霉的菌絲生長(zhǎng)和節(jié)孢子的形成［17］.CPCR1與 PACC或 CRE1蛋白是否存在相互作用，目前還缺少研究.

頭孢菌素生物合成基因簇中存在一個(gè)調(diào)控基因cefR，位于cefP基因的上游.cefR編碼的蛋白通過(guò)作用于cefT的啟動(dòng)子區(qū)來(lái)調(diào)控CPC的產(chǎn)生，當(dāng)敲除cefR基因后，cefEF的轉(zhuǎn)錄明顯延遲，頭孢菌素C的產(chǎn)量明顯減少，而積累了大量的PenN［43］.

目前對(duì)頭孢菌素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還缺乏深入系統(tǒng)的了解.相信頭孢菌素的生物合成受控于一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用現(xiàn)代的組學(xué)分析技術(shù)和遺傳操作等手段將全面揭示這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)頂頭孢霉的定向遺傳改造和促進(jìn)頭孢菌素的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義.

4 頂頭孢霉的形態(tài)分化與頭孢菌素產(chǎn)生

頂頭孢霉能夠產(chǎn)生兩種形態(tài)的無(wú)性孢子，分別是分生孢子和節(jié)孢子［44］.在合適的培養(yǎng)條件下，頂頭孢霉的分生孢子或節(jié)孢子在固體培養(yǎng)基上開(kāi)始萌發(fā)，通過(guò)極性生長(zhǎng)形成管狀的營(yíng)養(yǎng)菌絲.營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)到一定階段，受到外界信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)（如營(yíng)養(yǎng)脅迫等）刺激，部分營(yíng)養(yǎng)菌絲特化為足細(xì)胞，進(jìn)而由足細(xì)胞長(zhǎng)出分生孢子柄，分生孢子柄末端膨大形成分生孢子囊并產(chǎn)生分生孢子.當(dāng)分生孢子囊破裂時(shí)，釋放出其中的分生孢子，并進(jìn)入到下一個(gè)生命周期（圖4）.在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，菌絲膨大，形成節(jié)孢子（成串的酵母狀細(xì)胞），節(jié)孢子斷裂，并進(jìn)入到下一個(gè)生命周期.可見(jiàn)頂頭孢霉分生孢子的形成源于菌絲末端分化，而節(jié)孢子是在液體發(fā)酵過(guò)程中形成的一種菌絲膨大形態(tài).頂頭孢霉在形態(tài)分化的同時(shí)產(chǎn)生頭孢菌素C.當(dāng)頂頭孢霉生長(zhǎng)到穩(wěn)定期或在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸（頭孢菌素C產(chǎn)生的促進(jìn)劑），都會(huì)促進(jìn)頂頭孢霉產(chǎn)生大量的節(jié)孢子，隨之頭孢菌素C開(kāi)始大量合成.暗示頂頭孢霉的形態(tài)分化與頭孢菌素C的合成具有緊密的聯(lián)系.因此，在頭孢菌素的工業(yè)化生產(chǎn)中，人們往往通過(guò)頂頭孢霉的形態(tài)變化（產(chǎn)生節(jié)孢子的數(shù)量）來(lái)判斷發(fā)酵的成功與否［25］.然而，迄今為止鮮有頂頭孢霉形態(tài)分化的報(bào)道，更缺乏從分子水平對(duì)頂頭孢霉形態(tài)分化與頭孢菌素C產(chǎn)生之間內(nèi)在關(guān)系的研究.

圖4 頂頭孢霉的生長(zhǎng)及形態(tài)分化Fig.4 The growth and morphological differentiation of A.chrysogenum

為闡明頂頭孢霉形態(tài)分化的調(diào)控機(jī)制，尤其是形態(tài)分化與頭孢菌素產(chǎn)生之間的內(nèi)在關(guān)系，我們課題組建立和完善了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的頂頭孢霉的遺傳操作體系，并對(duì)預(yù)測(cè)的參與形態(tài)分化關(guān)鍵基因開(kāi)展了研究.發(fā)現(xiàn)敲除參與頂頭孢霉細(xì)胞分隔及節(jié)孢子形成的AcsepH基因，導(dǎo)致cefEF、cefD1和cefD2以及控制節(jié)孢子形成的cpcR1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低［45］.敲除參與頂頭孢霉硫氧還蛋白還原酶基因ActrxR1不僅顯著增加了產(chǎn)孢能力，而且增強(qiáng)了pcbC、cefEF和cefG的轉(zhuǎn)錄水平，使頭孢菌素C的合成提高了近一倍［46］.敲除AcstuA基因不僅阻斷了頂頭孢霉分生孢子的產(chǎn)生，也使突變株喪失了產(chǎn)生頭孢菌素C的能力［47］.AcmybA基因缺失會(huì)明顯促進(jìn)分生孢子和節(jié)孢子的形成，同時(shí)頭孢菌素的產(chǎn)量也會(huì)明顯增加.反之，過(guò)表達(dá)AcmybA則抑制分生孢子和節(jié)孢子的形成，頭孢菌素C幾乎不再產(chǎn)生.分析發(fā)現(xiàn)AcmybA的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制頂頭孢霉形態(tài)分化關(guān)鍵基因AcbrlA的轉(zhuǎn)錄，在AcmybA過(guò)表達(dá)菌株中，組成型表達(dá)AcbrlA能夠使分生孢子和節(jié)孢子的形成恢復(fù)，但頭孢菌素C依然不能夠產(chǎn)生［48］.

5 頭孢菌素生產(chǎn)菌株的理性改造

發(fā)酵條件及參數(shù)（如氨基酸、碳氮源、磷酸鹽、溶氧及攪拌速度等）能影響青霉素和頭孢菌素C的產(chǎn)生，通過(guò)比較誘變育種形成的高產(chǎn)菌株與野生型出發(fā)菌株，在揭示抗生素高產(chǎn)機(jī)制的同時(shí)，也為育種和改良提供了理論基礎(chǔ).早期頭孢菌素C高產(chǎn)菌株主要通過(guò)物理或化學(xué)誘變（如UV、亞硝基胍、X射線或γ射線等）的方式篩選獲得.從早期的誘變育種到近年來(lái)分子遺傳學(xué)手段的引入，使頭孢菌素C的產(chǎn)量得到了大幅提升.然而，傳統(tǒng)誘變技術(shù)缺乏明確的靶點(diǎn)，需要大量的篩選工作，已經(jīng)不能夠滿足工業(yè)化發(fā)酵對(duì)菌種改造的需要.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以基因工程為代表的菌種改造策略成功應(yīng)用于頭孢菌素生產(chǎn)菌株的育種.不論是結(jié)構(gòu)基因倍增還是代謝途徑的定向遺傳改造，都成功實(shí)現(xiàn)了抗生素增產(chǎn)［49］.

在青霉素高產(chǎn)菌株中，生物合成基因簇的倍增被認(rèn)為是產(chǎn)量提高的一個(gè)重要原因［50］.而在頭孢菌素C產(chǎn)生菌中，迄今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在基因簇倍增的現(xiàn)象，很可能是由于頭孢菌素的生物合成基因分別位于不同染色體的2個(gè)基因簇上.通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)菌株中參與頭孢菌素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著提高了，同時(shí)參與前體氨基酸合成的關(guān)鍵酶對(duì)氨基酸反饋抑制敏感度降低.進(jìn)而發(fā)現(xiàn)通過(guò)傳統(tǒng)誘變獲得的高產(chǎn)菌株從頭孢菌素生物合成及其相關(guān)的初級(jí)代謝都發(fā)生了明顯改變［51］.

在產(chǎn)黃青霉或構(gòu)巢曲霉中增加pcbAB的表達(dá)，能夠顯著增加青霉素的產(chǎn)量［52］.pcbAB編碼的ACV合酶（ACVS）負(fù)責(zé)頭孢菌素合成的第一步反應(yīng)，也是決定頭孢菌素C產(chǎn)量的關(guān)鍵.然而，由于遺傳操作困難，在頂頭孢霉中還沒(méi)有通過(guò)定向改造pcbAB來(lái)增加頭孢菌素C產(chǎn)量的報(bào)道.由cefG編碼的?；D(zhuǎn)移酶是頭孢菌素合成中的另一個(gè)限速酶.在頂頭孢霉中通過(guò)引入額外的cefG基因來(lái)增加其表達(dá)水平能夠顯著提升頭孢菌素C的產(chǎn)量［53］.增加一個(gè)拷貝的cefEF-cefG，生產(chǎn)菌株在150 L發(fā)酵罐中頭孢菌素C的產(chǎn)量提高15% ～40%.利用來(lái)自構(gòu)巢曲霉的gpd基因啟動(dòng)子、產(chǎn)黃青霉gdh基因啟動(dòng)子或pcbC基因的啟動(dòng)子重建cefG的表達(dá)，都使DAC乙酰轉(zhuǎn)移酶活性明顯提高［54］.此外，在頂頭孢霉中過(guò)表達(dá)頭孢菌素生物合成基因簇中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cefT和cefP也能顯著促進(jìn)頭孢菌素C產(chǎn)量的提高［14，16］.

真菌細(xì)胞內(nèi)氧化-還原狀態(tài)以及活性氧（ROS）水平也能影響真菌的形態(tài)分化，進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生.頂頭孢霉glrA基因 （編碼谷胱甘肽還原酶）控制了菌體內(nèi)還原性／氧化型谷胱甘肽（GSH／GSSG）氧化還原平衡，該基因破壞后顯著影響孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，但通過(guò)外源補(bǔ)加甲硫氨酸能恢復(fù)表型［55］；而對(duì)硫氧還蛋白還原酶基因trxR1的研究則表明該基因阻斷后能有效提高頭孢菌素C 產(chǎn)生［46］.

頭孢菌素C的合成是一個(gè)極其耗氧的過(guò)程，而隨著菌絲的生長(zhǎng)，發(fā)酵液逐漸變稠，不利于氧氣傳遞.透明顫菌血紅蛋白（VHb）能夠促進(jìn)微生物細(xì)胞在低氧狀態(tài)的生長(zhǎng)以及蛋白合成.根據(jù)這一原則，當(dāng)將來(lái)源于透明顫菌的VHb編碼基因vgb轉(zhuǎn)入頂頭孢霉后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子能有效改善發(fā)酵后期菌絲氧利用速率，對(duì)頭孢菌素C產(chǎn)生的促進(jìn)作用也相當(dāng)明顯，在低氧情況下頭孢菌素 C的產(chǎn)量提高了5 倍［56］.

6 結(jié)束語(yǔ)與展望

近年來(lái)頂頭孢霉全基因組序列的完成，以及生產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組工作的完成，極大地促進(jìn)了人們對(duì)頭孢菌素生物合成及其調(diào)控的了解［51，57-59］.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析頭孢菌素高產(chǎn)菌株和低產(chǎn)菌株之間的差別，可以清楚看到參與甘油酯代謝、氨基酸代謝、半乳糖代謝、丙酮酸代謝、蘋(píng)果酸代謝以及嘧啶代謝等初級(jí)代謝通路的基因發(fā)生了顯著變化，在高產(chǎn)菌株中這些變化更有利于頭孢菌素C的合成.通過(guò)提升細(xì)胞內(nèi)L-α-AAA、L-半胱氨酸和L-纈氨酸的含量能夠顯著增加頭孢菌素C的產(chǎn)量.頭孢菌素的合成不僅與前體物有關(guān)，還與細(xì)胞內(nèi)的能量和還原力（NADPH）的產(chǎn)生直接相關(guān).

由于頭孢菌素C活性較低，并不能直接用于臨床.頭孢菌素C作為原料需要通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化或者酶法轉(zhuǎn)化為中間體7-氨基頭孢烷酸（7-ACA），再由7-ACA半合成一系列頭孢類(lèi)抗生素［60］.通過(guò)化學(xué)的脫乙酰化處理形成7-ACA，需要苛刻的反應(yīng)條件，并產(chǎn)生有毒物質(zhì).目前主要通過(guò)二步酶法獲得7-ACA.然而，不管是二步酶法還是一步酶法，對(duì)催化工藝都有很高的要求，同時(shí)，產(chǎn)物還需要進(jìn)一步純化處理.因此，構(gòu)建能夠直接發(fā)酵產(chǎn)生7-ACA的基因工程菌株成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).目前獲得的直接產(chǎn)生7-ACA菌株在產(chǎn)量上還達(dá)不到工業(yè)化水平，合成生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為重構(gòu)頂頭孢霉的代謝途徑、提高7-ACA的產(chǎn)量提供了技術(shù)支撐，相信通過(guò)直接發(fā)酵，工業(yè)化生產(chǎn)7-ACA很快會(huì)成為現(xiàn)實(shí).

雖然有了組學(xué)的一些研究，但對(duì)頭孢菌素生物合成及其調(diào)控機(jī)制仍然缺乏深入和系統(tǒng)的了解.同時(shí)由于缺乏有性世代，頂頭孢霉的遺傳操作相對(duì)困難（依賴于同源重組的傳統(tǒng)基因敲除效率不足5%），導(dǎo)致靶向重構(gòu)代謝途徑和理性改造頭孢菌素生產(chǎn)菌株依然困難重重.近期，華東理工大學(xué)儲(chǔ)炬教授課題組基于CRISPR／Cas9技術(shù)在頂頭孢霉野生株中實(shí)現(xiàn)了基因的高效敲除［61］.我們課題組通過(guò)串聯(lián)U6啟動(dòng)子和tRNA對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，在頭孢菌素高產(chǎn)菌株中實(shí)現(xiàn)了單基因的高效編輯、雙基因的一步敲除和大片段DNA的靶向敲除［62］.這些技術(shù)的進(jìn)步必將進(jìn)一步推動(dòng)對(duì)頭孢菌素生物合成及其調(diào)控機(jī)制的理解和工業(yè)化菌種的理性改造，從而推動(dòng)頭孢菌素工業(yè)化生產(chǎn)的升級(jí)換代.