環(huán)狀RNA CDR1as與miR-7在癲癇患者血漿中的表達及與腦電圖異常的關(guān)系分析

韓永凱，李斯娜，張萍，李靜，王旭生，張帆，杜愛玲，張留莎，宋景貴△

癲癇是腦神經(jīng)元突發(fā)間歇性癇樣放電引起腦部短暫功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，以神經(jīng)元過度、反復(fù)同步異常放電為主要特征，死亡危險性較高，是一般人群的2～3 倍［1-2］。全球約有 5 000 萬癲癇患者，其中中國癲癇患者約有600萬，每年新發(fā)癲癇患者約有40萬［3］。而經(jīng)過規(guī)范治療后，通常1/3癲癇患者不能完全控制發(fā)作，嚴重影響患者的正常生活［4］。因此，探索與癲癇發(fā)病有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，對于臨床監(jiān)測及治療癲癇有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）參與退行性神經(jīng)病變及腦缺血所致神經(jīng)損傷過程，在癲癇的發(fā)生中具有重要作用［5］。miR-7 是 miRNA 家族重要成員，在腦組織中表達水平較高，參與腦部炎癥以及相關(guān)疾病發(fā)生［6］。小腦變性相關(guān)蛋白1 反義轉(zhuǎn)錄物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一種環(huán)狀RNA，可通過miR-7 途徑間接調(diào)控miR-7靶基因，影響疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。但 CDR1as 和miR-7在癲癇中的作用尚不明確。本研究將通過檢測癲癇患者血漿中CDR1as和miR-7的表達水平，初步探討兩者與患者腦電圖異常的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016 年12 月—2019 年12 月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診及住院的癲癇患者87例為觀察組，結(jié)合腦電圖、磁共振成像結(jié)果確診為原發(fā)性癲癇者。選取同期健康體檢者90例為對照組。收集2組性別、年齡和體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他腦組織病變，急慢性炎癥性疾病，自身免疫性疾病，心、肝或腎等重要臟器損傷，惡性腫瘤，嚴重胃腸道疾病，精神疾病，甲狀腺功能障礙及其他代謝性疾病者。（2）由腦血管意外、顱內(nèi)感染等顱內(nèi)病變導(dǎo)致的繼發(fā)性癲癇者。（3）有藥物、乙醇依賴史者。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核，符合相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定，所有研究對象知情且簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol 試劑（貨號：QN2070-ZOG）購自北京百奧萊博科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：BPI01030）購自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）試劑盒（貨號：DEM202-50T）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；白細胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子-α（TNF）-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：SEKCN-0007-96Time、SEKRT-0402-96Time、SEKMY-0002-96Time）購自北京索萊寶科技有限公司；qPCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。qPCR 儀（型號：QuantStudio 6 Flex）購自Life Technologies公司，酶標(biāo)儀（型號：Varioskan LUX）購自Thermo Fisher公司。

1.3 血漿的檢測 清晨抽取受試者空腹外周靜脈血6 mL，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取血漿，分成2份。其中一份采用qRT-PCR法檢測，即按照TRIzol試劑盒說明書提取血漿中總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 完整性，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢驗cDNA 質(zhì)量。以GAPDH、U6 為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 40次。CDR1as 上游引物 5′-TAGTACGTCGTGCCCTGA-3′，下游引物5′-CACTTGACGTGCAGCATC-3′，產(chǎn)物大小2 116 bp；miR-7 上游引物 5′-CCACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3′，下游引物 5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′，產(chǎn)物大小21 bp；內(nèi) 參 GAPDH 上 游 引 物 5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′，產(chǎn)物大小1 285 bp；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物大小 207 bp。采用 2-ΔΔCt法計算血漿 CDR1as、miR-7 相對表達量。取另外一份血漿應(yīng)用ELISA法檢測，具體操作均按照試劑盒說明書進行。使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血漿 IL-2、TNF-α 和 IL-1β水平。

1.4 腦電圖檢查 采用腦電圖儀對癲癇患者進行檢查，按照國際10/20 系統(tǒng)安置電極，采用常規(guī)單極和雙極導(dǎo)聯(lián)描記腦電圖波形。檢查過程中，對患者進行閃光刺激及過度呼吸誘發(fā)試驗，描記時間均超過20 min。由本院腦電圖室高資歷醫(yī)生根據(jù)腦電圖作出診斷并依腦電圖結(jié)果將87 例癲癇患者分為正常組（6 例）、輕度異常組（18 例）、中度異常組（37 例）及重度異常組（26 例）。正常：α 或β 節(jié)律為主，左右對稱；輕度異常：α 節(jié)律不規(guī)則或不穩(wěn)定，出現(xiàn)高波幅β 波，同時Q 波在各區(qū)的活動增加；中度異常：α 節(jié)律不對稱且可能消失，Q 波陣發(fā)性發(fā)作，過度換氣后高波幅δ 波成群出現(xiàn)；重度異常：Q 波、δ 波彌散性發(fā)作，α 波變慢甚至消失，δ 波陣發(fā)性出現(xiàn)，且可自發(fā)或誘發(fā)高波幅的棘波、棘慢綜合波、尖波。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較行獨立樣本t檢驗；多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；計數(shù)資料均以例（%）表示，組間比較行χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組受試者一般資料比較 5組受試者性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不同程度腦電圖異常癲癇患者病程比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

Tab.1 Comparison of the general data between the five groups of patients表1 5組受試者一般資料比較

2.2 5 組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β 水平比較 對照組、正常組、輕度異常組、中度異常組、重度異常組的血漿CDR1as、IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平總體呈升高變化，miR-7 水平總體呈降低變化（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比較 （）

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比較 （）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與正常組比較，c與輕度異常組比較，d與中度異常組比較，P＜0.05

組別對照組正常組輕度異常組中度異常組重度異常組F n 90 6 18 37 26 CDR1as 1.01±0.08 1.09±0.08 1.18±0.09a 1.25±0.11ab 1.33±0.13abcd 78.656＊＊miR-7 1.03±0.18 0.94±0.14 0.80±0.12a 0.61±0.09abc 0.53±0.11abcd 87.708＊＊IL-2（μg/L）146.45±27.86 175.64±11.65a 193.23±14.82a 229.86±20.86abc 246.32±16.44abc 137.916＊＊組別對照組正常組輕度異常組中度異常組重度異常組F TNF-α（μg/L）87.53±14.08 88.62±12.02 104.41±12.84a 137.08±13.65abc 144.42±14.57abc 137.321＊＊IL-1β（μg/L）47.65±13.69 63.52±8.02a 81.49±10.68ab 100.43±11.37abc 109.95±12.08abcd 193.765＊＊

2.3 癲癇患者血漿CDR1as、miR-7 水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，癲癇患者血漿CDR1as 水平與IL-2、TNF-α和 IL-1β 水平呈正相關(guān)（r分別為 0.416、0.428 和0.443，P＜0.05），miR-7 水平與 IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平呈負相關(guān)（r分別為-0.483、-0.455 和-0.507，P＜0.05）。

3 討論

癲癇是較為常見的神經(jīng)科疾病，是由多種原因引起的慢性腦功能紊亂所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。癲癇患者腦內(nèi)病灶部位的神經(jīng)細胞放電異常會引起運動、感覺、意識、行為及自主神經(jīng)的不同障礙，通常反復(fù)發(fā)作，但亦可自然緩解。75%～80%癲癇患者首次發(fā)作在18 歲以前，但成年人、老年人發(fā)病也不少見。流行病學(xué)調(diào)查顯示，癲癇的發(fā)病率為1%～2%［8］。然而，20%～30%患者使用一種甚至多種抗癲癇藥物治療的效果均較差，仍反復(fù)發(fā)作，影響患者身體及心理健康［9］。有研究顯示，癲癇的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)有關(guān)，癲癇發(fā)病可激活炎癥細胞釋放炎癥細胞因子，發(fā)生全身炎癥反應(yīng)，進而引起相應(yīng)血清學(xué)指標(biāo)的改變［10］。因此，尋找與癲癇炎癥反應(yīng)發(fā)生有關(guān)的指標(biāo)，闡明其分子機制，尋找新的分子治療靶點，進行有效的干預(yù)阻斷對臨床治療具有重要意義。

miRNA 是一類長度為19～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達，參與疾病的發(fā)生發(fā)展［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在腦部炎癥、癲癇的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［12-13］。miR-7 在癲癇中的作用尚少見報道，但有研究表明，miR-7在腦組織中表達水平較高，在腦組織炎性損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［6，14］。環(huán)狀RNA 是一類缺乏 5′、3′末端共價結(jié)合的單鏈RNA 環(huán)狀分子，具有穩(wěn)定保守、組織特異性及發(fā)育階段特異性表達等特點［15］。CDR1as 是一種與多種腫瘤及神經(jīng)性疾病發(fā)生相關(guān)的環(huán)狀RNA，其可通過競爭性內(nèi)源RNA 途徑阻礙miR-7 功能或發(fā)揮miR-7 的海綿作用，大量儲存 miRNA-7 并適時釋放［16］。Yang等［17］研究表明，CDR1as 可充當(dāng)miR-7 海綿，將其沉默后可增強乳腺癌細胞對藥物的敏感性。另有研究表明，CDR1as在膠質(zhì)瘤組織中表達水平顯著低于正常腦組織，因此其認為環(huán)狀RNA CDR1as 可能是作為抑癌基因參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性生長［7］。本研究結(jié)果顯示，各組癲癇患者較健康體檢者血漿CDR1as 水平顯著升高，miR-7 水平顯著降低，且隨著患者腦電圖異常發(fā)生及腦電圖異常程度加重，血漿CDR1as 水平依次升高，miR-7 水平依次降低，提示CDR1as、miR-7 參與癲癇發(fā)生發(fā)展，并與患者腦電圖異常程度有關(guān)，但具體機制還需進一步研究。

眾多研究表明癲癇的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)有關(guān)。Zhou等［18］研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白（HMGB）-1、IL-2和IL-6等炎癥因子參與癲癇發(fā)生發(fā)展過程。韋倩娜等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β 參與癲癇發(fā)生，與患者腦電圖異常程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，各組癲癇患者較健康體檢者血漿IL-2、TNF-α 和IL-1β 水平顯著升高，且隨腦電圖異常發(fā)生及程度加重而逐漸升高，提示IL-2、TNF-α、IL-1β 參與癲癇患者的炎癥反應(yīng)過程，在癲癇發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且其水平與腦電圖異常存在一定關(guān)系，與惲鴻博等［20］研究結(jié)果一致。神經(jīng)系統(tǒng)中TNF-α 主要由膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的，當(dāng)癲癇發(fā)作時，血腦屏障遭到破壞后，TNF-α通過血腦屏障進入腦內(nèi)，同時神經(jīng)元異常放電以及周圍神經(jīng)膠質(zhì)細胞也會促進TNF-α 的合成和分泌，參與癲癇疾病的發(fā)生；另外TNF-α 還可通過一系列級聯(lián)反應(yīng)促進膠質(zhì)細胞中IL-2、IL-1β等癲癇相關(guān)細胞因子表達，而這些炎癥因子又進一步通過加強神經(jīng)元功能和誘導(dǎo)炎性反應(yīng)促進癲癇疾病的發(fā)生。進一步研究顯示，癲癇患者血漿CDR1as水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈顯著正相關(guān)，miR-7水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈顯著負相關(guān)，提示CDR1as、miR-7 與IL-2、TNF-α、IL-1β 密切相關(guān)，推測CDR1as、miR-7 可能通過影響患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程影響疾病的發(fā)生發(fā)展，但是由于目前關(guān)于CDR1as、miR-7在癲癇發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究較少，兩者對癲癇的作用機制尚不明確，還有待進一步分析。

綜上所述，血漿CDR1as、miR-7 水平與癲癇患者腦電圖異常密切相關(guān)，分別隨著腦電圖異常發(fā)生及程度加重而升高或降低，兩者可能通過影響患者血漿IL-2、TNF-α、IL-1β 水平參與對癲癇患者腦電圖異常發(fā)生及加重的調(diào)控，但CDR1as、miR-7 在癲癇中的具體作用機制還需擴大樣本量進行深入研究。