靈芝多糖粗提物對(duì)雌二醇誘導(dǎo)小鼠胸腺萎縮的改善作用研究

孫嫣 范新 王剛 朱韻辰

摘 要 目的：研究靈芝多糖粗提物對(duì)雌二醇誘導(dǎo)小鼠胸腺萎縮的改善作用。方法：將60只雌性ICR小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和靈芝多糖粗提物高、低劑量組（400、100 mg/kg，以生藥量計(jì)），每組15只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均隔天腹腔注射雌二醇（0.1 mg/只，共6次）建立胸腺萎縮模型。造模結(jié)束后次日，小鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥24 h后，測(cè)定小鼠臟器（胸腺、脾）指數(shù)以及血漿中丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性，采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠胸腺、脾組織的病理學(xué)變化，采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡情況，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其外周血中T細(xì)胞亞群分類。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例、CD4+/CD8+T比值均顯著降低（P<0.01），脾指數(shù)、血漿中MDA含量、胸腺細(xì)胞凋亡水平以及外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;小鼠胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)分界模糊、細(xì)胞間隙增大、皮質(zhì)出現(xiàn)部分細(xì)胞損傷凋亡，脾組織未見明顯病理學(xué)變化。與模型組比較，靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、血漿中GST活性以及外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01），血漿中MDA含量、胸腺細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），且胸腺組織病理學(xué)變化明顯改善;靈芝多糖粗提物低劑量組小鼠僅血漿中MDA含量顯著降低（P<0.01），其余指標(biāo)/病理學(xué)變化均不明顯。結(jié)論：高劑量（400 mg/kg）靈芝多糖粗提物對(duì)雌二醇誘導(dǎo)的小鼠胸腺萎縮具有一定的改善作用。

關(guān)鍵詞 靈芝多糖粗提取;雌二醇;胸腺萎縮;免疫調(diào)節(jié);小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Ganoderma lucidum polysaccharides crude extract on estradiol-induced thymus atrophy in mice. METHODS： Totally 60 female ICR mice were randomly divided into normal control group （normal saline）， model group （normal saline）， G. lucidum polysaccharides crude extract high-dose and low-dose groups （400， 100 mg/kg， by crude drug）， with 15 mice in each group. Except for normal control group， other groups were given estradiol intraperitoneally （0.1 mg/mice， 6 times） every other day to establish thymic atrophy model. The next day after modeling finished， they were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. Twenty-four hours after last medication， organ （thymus， spleen） index， MDA content and GST activity in plasma were determined. HE staining was adopted to observe the pathological changes of thymus and spleen tissue in mice. The thymus cell apoptosis was examined by TUNEL assay， and the T cell subsets in peripheral blood were detected by flow cytometry. RESULTS： Compared with normal control group， the thymus index， proportion of CD3+CD4+T cell in peripheral blood and CD4+/CD8+ ratio were decreased significantly in model group （P<0.01）; spleen index， MDA content in plasma and thymocyte apoptosis level as well as the proportion of CD3+CD8+T cell in peripheral blood were all increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Thymic cortex and medullary boundary of mice was blurred; the intercellular space was enlarged; some cells were damaged and apoptotic in cortex; no pathological changes were found in the spleen. Compared with model group， thymus index and GST activity in plasma as well as proportion of CD3+CD4+T cell in peripheral blood and CD4+/CD8+ ratio were all increased significantly in G. lucidum polysaccharides crude extract high-dose group （P<0.05 or P<0.01）; while MDA content in plasma， the apoptosis level of thymocytes were all decreased significantly （P<0.01 or P<0.05）; and the pathological changes of thymus were improved significantly. MDA content in plasma was decreased significantly in G. lucidum polysaccharides crude extract low-dose group （P<0.01）， and other indexes/pathological changes were not obvious. CONCLUSIONS： High dose （400 mg/kg） of G. lucidum polysaccharides crude extract can improve the thymus atrophy induced by estradiol in mice.

KEYWORDS Ganoderma lucidum polysaccharide crude extract; Estradiol; Thymus atrophy; Immunomodulation; Mice

靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharides）為名貴中藥材靈芝的主要藥效成分之一，其種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量從幾百到幾十萬不等，到目前為止，被人們發(fā)現(xiàn)的靈芝多糖已經(jīng)超過200種[1]。靈芝多糖主要來源為靈芝子實(shí)體多糖、發(fā)酵液多糖以及液體發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體多糖[2]。靈芝多糖作為一種有效免疫調(diào)節(jié)劑，能夠全面且有效地影響免疫細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等）的功能，同時(shí)釋放趨化因子、生長(zhǎng)因子，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的適應(yīng)性免疫[3]，其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的功效已成為研究熱點(diǎn)[4]。胸腺作為免疫系統(tǒng)重要的中樞器官，與機(jī)體的健康息息相關(guān)。但自然衰老、病毒感染、藥物誘導(dǎo)以及外傷等均可能會(huì)誘導(dǎo)胸腺萎縮，從而導(dǎo)致免疫力下降，加速衰老與疾病的發(fā)生[5]。在前期的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉對(duì)胸腺萎縮有一定的改善作用，而靈芝多糖是其主要藥效成分之一，故本研究擬探索靈芝多糖對(duì)雌二醇誘導(dǎo)小鼠胸腺萎縮的影響，明確靈芝多糖調(diào)節(jié)免疫的藥效作用，為靈芝藥用成分的深入開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ME204E型萬分之一分析天平、DM4000型生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）;CS120FNX型微量超速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）;M200Pro型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;NovoCyte型流式細(xì)胞儀（美國(guó)ACEA Biosciences公司）。

1.2 藥品與試劑

靈芝菌粉（浙江方格藥業(yè)有限公司，批號(hào)：10141-3-160517）;苯甲酸雌二醇注射液[上海全宇生物科技（駐馬店）動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：190504，規(guī)格：4 mg ∶ 2 mL];丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200218、20200316）;原位末端標(biāo)記法（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：080919190826）;CD3-別藻藍(lán)蛋白（APC）、CD4-藻紅蛋白（PE）、CD8-異硫氰酸（FITC）抗體（美國(guó)Biogems公司，批號(hào)：80E041705122、60E271706122、50M281710- 112）;其余試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制三蒸水。

1.3 動(dòng)物

健康ICR小鼠60只，雌性，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，質(zhì)量合格證號(hào)：1912180039。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度為18～26 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%、光照明暗交替（各12 h）、每小時(shí)通風(fēng)22次。實(shí)驗(yàn)方案符合《浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》對(duì)動(dòng)物倫理的要求。

2 方法

2.1 靈芝多糖粗提物的制備

取靈芝菌粉80 g，加1 600 mL水，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）提取2次（第1次提取1 h、第2次提取0.5 h），過濾，合并2次濾液。將濾液60 ℃減壓濃縮至1 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，加入95%乙醇400 mL調(diào)溶液的醇體積分?jǐn)?shù)為80%，混勻，4 ℃下靜置24 h，然后以4 000 r/min離心20 min，棄去上清液。取沉淀，冷凍干燥即得靈芝多糖粗提物，得率為5%。用硫酸蒽酮法[6]測(cè)得其多糖含量為15%。

2.2 分組、造模與給藥

將60只小鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)分組表分為4組，每組15只，分別為正常對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和靈芝多糖粗提物高、低劑量組（400、100 mg/kg，以生藥量計(jì)）[7]。模型組和靈芝多糖粗提物高、低劑量組小鼠隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液（0.1 mg/只）1次，共注射6次（造模用時(shí)11 d）;正常對(duì)照組小鼠不作任何實(shí)驗(yàn)操作。于造模完成后次日開始給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

2.3 取材與樣本處理

末次給藥24 h后，稱定小鼠體質(zhì)量并從眼內(nèi)眥取血（約0.5 mL），將血樣置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）抗凝管中，渦旋搖勻，備用。取血后將小鼠脫頸椎處死，取出胸腺和脾，稱質(zhì)量，將胸腺和脾組織置于福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)病理學(xué)檢測(cè)。

2.4 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定

根據(jù)“2.3”項(xiàng)下測(cè)定的末次給藥24 h后小鼠體質(zhì)量和臟器（胸腺、脾）質(zhì)量計(jì)算其臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器（胸腺、脾）質(zhì)量（mg）/末次給藥24 h后體質(zhì)量（g）。

2.5 小鼠血漿中MDA含量和GST活性檢測(cè)

取適量抗凝血，以3 000 r/min離心15 min，然后取上層血漿，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測(cè)血漿中MDA含量和GST活性。

2.6 小鼠胸腺、脾組織的病理學(xué)變化觀察

將小鼠胸腺、脾組織置于福爾馬林溶液中固定1周后取出，常規(guī)制作石蠟切片（厚度5 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后于顯微鏡下觀察胸腺和脾組織的病理學(xué)變化。

2.7 小鼠胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下各組小鼠胸腺組織石蠟切片（每組選3個(gè)組織樣本），置于防脫載玻片上，55 ℃下烤片2 h，然后按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（顯色法）說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)胸腺組織中胸腺細(xì)胞的凋亡情況（鏡下可見凋亡細(xì)胞被染色成棕褐色）。使用Image J 1.52a軟件根據(jù)陽(yáng)性染色面積進(jìn)行半定量分析。每個(gè)組織隨機(jī)選取2個(gè)面積相同的視野并計(jì)算選擇視野下陽(yáng)性染色面積的相對(duì)面積百分比（即陽(yáng)性染色面積占總面積的百分比），用來表示細(xì)胞凋亡水平。

2.8 小鼠外周血中T細(xì)胞分類檢測(cè)

取100 μL小鼠抗凝血（每組取10個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定），加入CD3-APC、CD4-PE、CD8-FITC熒光抗體，充分混勻，室溫下避光孵育15 min。孵育結(jié)束后，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫下避光處理15 min，然后以500×g離心5 min，棄去上清液;加入1 mL常溫?zé)o菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，再次以500×g離心5 min，棄去上清液;加入0.5 mL常溫?zé)o菌PBS重懸后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析外周血中T細(xì)胞亞群比例。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠臟器質(zhì)量和臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.01），脾質(zhì)量和脾指數(shù)均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.01）。各組小鼠胸腺、脾質(zhì)量及其臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 小鼠血漿中MDA含量和GST活性檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組，模型組小鼠血漿中MDA含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，靈芝多糖粗提物高、低劑量組小鼠血漿中MDA含量均顯著降低（P<0.01），且靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠血漿中GST活性顯著升高（P<0.05）。各組小鼠血漿中MDA含量與GST活性檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.3 小鼠胸腺和脾組織病理學(xué)變化觀察結(jié)果

3.3.1 胸腺組織 正常對(duì)照組小鼠胸腺組織皮質(zhì)髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞排列整齊，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體。模型組小鼠胸腺組織皮質(zhì)變薄，其中胸腺細(xì)胞數(shù)明顯減少、結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞間隙增大，可見大量網(wǎng)狀上皮細(xì)胞，皮質(zhì)分界較為模糊。靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠胸腺組織皮質(zhì)與髓質(zhì)分界較為清晰，細(xì)胞排列規(guī)整。靈芝多糖粗提物低劑量組小鼠胸腺組織病理學(xué)變化雖較模型組有一定改善，但皮質(zhì)髓質(zhì)分界仍不夠清晰，細(xì)胞間隙仍較大。各組小鼠胸腺組織病理學(xué)顯微圖見圖1。

3.3.2 脾組織 各組別小鼠的脾組織被膜均完整，白髓、紅髓組織均清晰，淋巴小結(jié)分布均無顯著變化，HE染色結(jié)果顯示各組間未見明顯差異。各組小鼠脾組織病理學(xué)顯微圖見圖2。

3.4 小鼠胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺細(xì)胞凋亡水平顯著升高（P<0.01），皮質(zhì)、髓質(zhì)均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。與模型組比較，靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠胸腺細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠胸腺組織細(xì)胞凋亡顯微圖見圖3，細(xì)胞凋亡水平測(cè)定結(jié)果見圖4。

3.5 小鼠外周血中T細(xì)胞分類檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著降低（P<0.01），CD3+CD8+T細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著升高（P<0.01）。各組小鼠外周血流式細(xì)胞儀分析結(jié)果見圖5，T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果見表3。

4 討論

在本研究中，模型組小鼠胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)顯著降低，而脾質(zhì)量及脾指數(shù)顯著升高。在小鼠受到雌二醇刺激出現(xiàn)胸腺萎縮后，機(jī)體免疫力隨之下降，故筆者認(rèn)為，此時(shí)脾臟增大是機(jī)體為了提高自身免疫水平而出現(xiàn)的代償性增長(zhǎng)，故脾臟HE染色結(jié)果中也未發(fā)現(xiàn)組織出現(xiàn)病變。MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要指標(biāo)，可反映血液系統(tǒng)中氧自由基的水平[8]。GST是體內(nèi)解毒系統(tǒng)的組成部分，該指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)藥物干預(yù)后，是否可以增強(qiáng)機(jī)體的解毒水平[8]。本研究結(jié)果顯示，高劑量靈芝多糖粗提物可以明顯降低血漿中MDA含量，從而減輕氧化作用;并且其還可顯著提高血漿中GST活性，從而提升機(jī)體的解毒能力。根據(jù)胸腺組織的病理學(xué)觀察結(jié)果以及胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果來看，高劑量靈芝多糖粗提物可一定程度地減輕模型小鼠胸腺細(xì)胞的損傷，改善其胸腺組織的萎縮，但對(duì)小鼠脾指數(shù)并無顯著改善，這說明靈芝多糖粗提物對(duì)該模型小鼠脾臟無明顯影響。

胸腺作為哺乳動(dòng)物T細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的主要場(chǎng)所，為T細(xì)胞的發(fā)育提供了一個(gè)完善而復(fù)雜的微環(huán)境，可有序地調(diào)控T細(xì)胞的成熟和遷移[5]。胸腺作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵器官之一，在青少年時(shí)期發(fā)育達(dá)到頂峰，隨著年齡的增長(zhǎng)，胸腺每年約以3%的體積逐漸萎縮，中老年后胸腺逐漸脂肪化，功能也隨之減弱，這也是老年人免疫力低下、更容易患病的原因之一[9-10]。同時(shí)，外界因素如病毒感染、疾病、藥物以及激素水平變化等都是造成胸腺萎縮的誘因，胸腺的萎縮將會(huì)造成機(jī)體抵抗力的進(jìn)一步下降[11-12]。若以抑制胸腺萎縮作為藥物研究的方向，將會(huì)對(duì)疾病的治療以及維持機(jī)體的健康起到積極的作用。

T細(xì)胞亞群間的比值是反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，在分析發(fā)病機(jī)制、觀察療效及監(jiān)測(cè)預(yù)后中具有重要意義[13]。T細(xì)胞亞群主管細(xì)胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用，其細(xì)胞功能取決于T細(xì)胞總值（CD3+）及其亞群（CD4+、CD8+）的相對(duì)組成。正常情況下，T細(xì)胞亞群間互相拮抗達(dá)到平衡;當(dāng)免疫失衡時(shí)，T細(xì)胞亞群的比值變化紊亂，則易引發(fā)疾病[14]。CD4+是誘導(dǎo)與輔助的T細(xì)胞，是調(diào)控免疫反應(yīng)的樞紐細(xì)胞;CD8+是抑制與毒殺的T細(xì)胞，是免疫反應(yīng)直接殺傷性細(xì)胞。CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體免疫功能的情況，當(dāng)該比值下降時(shí)則表明機(jī)體免疫處于被抑制的狀態(tài)[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例較正常對(duì)照組顯著下降，CD3+CD8+T細(xì)胞比例較正常對(duì)照組顯著上升。這說明在雌二醇作用下，起誘導(dǎo)與輔助作用的CD3+CD4+T細(xì)胞受到了抑制，導(dǎo)致CD4+/CD8+比值降低，機(jī)體免疫力下降。靈芝多糖粗提物高劑量組小鼠給藥后外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值較模型組顯著升高，這說明靈芝多糖粗提物可提高CD3+CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控機(jī)體免疫力;而靈芝多糖粗提物低劑量的調(diào)控效果相對(duì)不明顯。

綜上所述，本文研究了靈芝多糖粗提物對(duì)雌二醇誘導(dǎo)的小鼠胸腺萎縮的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量（400 mg/kg）靈芝多糖粗提物對(duì)該模型小鼠的胸腺萎縮具有一定的改善作用。由于臨床上并無針對(duì)胸腺萎縮癥狀的藥物，故本研究未設(shè)置陽(yáng)性藥物組。此外，本研究所用的靈芝多糖為粗提物，在后期研究中，筆者將會(huì)通過優(yōu)化工藝，對(duì)更高純度靈芝多糖的藥效及其改善胸腺萎縮作用的可能機(jī)制開展進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-05-12 修回日期：2020-07-12）

（編輯：林 靜）