甲狀腺濾泡癌中miR-133的表達及其診斷意義

李 瑩，刁為英，王彩霞，曲燦華，孫玉鴻，李 升，徐 輝

甲狀腺癌是臨床內分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來國內外甲狀腺癌的發(fā)病率不斷攀升，成為專業(yè)領域的關注焦點[1]。超過90%的甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer, DTC)，即甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)和甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)。其中PTC最常見，占甲狀腺癌的60%～70%，F(xiàn)TC占甲狀腺癌的20%～25%，但其惡性度較PTC高，尤其血行轉移率較高。對于FTC的診斷，臨床病理醫(yī)師主要通過術中、術后組織病理切片顯示包膜及血管侵犯程度進行判斷[2]。但在診斷工作中因為切面及取材關系，經常不能完整顯示腫瘤的包膜及血管侵犯程度，這使FTC的確診一直成為臨床病理工作者關注的焦點。本實驗擬通過qRT-PCR技術檢測FTC、PTC及結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中miRNA-133的表達，分析miRNA-133的表達差異為FTC的診斷提供客觀的依據(jù)，并進一步探討miRNA-133作為腫瘤標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年11月～2017年12月佳木斯大學附屬第一醫(yī)院診治的甲狀腺癌患者60例，臨床病理資料見表1。FTC患者30例，其中男性4例，女性26例，年齡11～80歲，平均(45±6.8)歲；PTC患者30例，其中男性10例，女性20例，年齡18～65歲，平均(40.83±3.5)歲。結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤患者30例，其中男性11例，女性19例，年齡15～76歲，平均(44.72±13.03)歲。納入標準：(1)納入患者經兩名副主任及以上病理醫(yī)師明確診斷；(2)甲狀腺癌患者未患有其它惡性腫瘤疾病，結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤患者未患有惡性腫瘤疾?。?3)患者均未接受放、化療；(4)患者基本臨床資料均完整。

1.2 標本與試劑標本取自新鮮的石蠟標本，8 μm厚切片，用1.5 mL無RNA酶EP管收集至-20 ℃冰箱保存。石蠟包埋組織miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量試劑盒、has-miR-133a-3p檢測引物均購自天根生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1總RNA的提取 將裝有組織切片的EP管加入1 mL二甲苯，離心2 min；吸取上清后加入1 mL無水乙醇于沉淀中，離心2 min；吸取上清，打開管蓋，室溫放置直至乙醇揮發(fā)完全；加入150 μL裂解液，振蕩器振蕩混勻，55 ℃、80 ℃各孵育15 min；冰上放置3 min，離心15 min，轉移上清至新的離心管中，加入16 μL RDDbuffer，顛倒混勻，室溫放置15 min，離心后加入320 μL緩沖液RB；混勻后加入1 120 μL無水乙醇，混勻，轉移至吸附柱，離心，棄掉廢液，重復上一步驟；加入漂洗液，室溫放置2 min，離心后棄廢液，吸附柱轉入新的離心管中，置于室溫晾干后滴加去離子水100 μL，離心2 min。

1.3.2cDNA合成 參照miRNAcDNA反轉錄試劑盒說明書進行。將反應體系試劑組分加至總體積20 μL，移液器混勻，設置反應程序，上機。合成的cDNA反應液放置于-20 ℃保存。

1.3.3qRT-PCR檢測 實驗操作條件要求在冰上進行，將cDNA用蒸餾水稀釋10倍后，充分混勻，取稀釋后的cDNA 2 μL，再加入7.2 μL無酶水、10 μL Premix、0.4 μL Reverse Primer、2 μL Rox。每個樣本重復檢測3次，引物序列miR-133a-3p：5′-UUUGG UCCCCUUCAACCAGCUG-3′，以U6作為內參，各樣本得出的Ct值為達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，miR-133在甲狀腺癌和結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中的相對表達量用△Ct=Ct實驗-CtU6計算，最終結果用2-△△Ct表示。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0.0軟件進行統(tǒng)計學分析，非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)及其四分位間距[M(Q1,Q3)]表示，組間比較采用秩和檢驗進行統(tǒng)計，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用ROC曲線分析miR-133檢測的特異度與靈敏度，并判斷miR-133對于FTC的臨床診斷效能。

1.5 結果判斷ROC曲線下面積(area under curve, AUC)越接近1.0，說明該實驗診斷價值越大，AUC>0.9以上，提示該實驗有較高的診斷價值；0.7≤AUC≤0.9，說明該實驗有一定的診斷價值；0.5

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中miR-133的表達本組實驗結果顯示，miR-133在FTC與PTC及結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤中的表達差異有顯著性(Z=9.917，P=0.007，表2)；miR-133在FTC組中的表達低于PTC組(Z=-2.706，P=0.007)；miR-133在FTC組中的表達低于結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組(Z=-2.737，P=0.006)；miR-133在PTC組中表達與結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中的表達差異無顯著性(Z=-0.31，P=0.757)。miR-133可以用來鑒別FTC與PTC及結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤病變。

2.2 FTC組織中miR-133相對表達與臨床病理特征的關系統(tǒng)計結果顯示，miR-133的表達與FTC腫瘤分期密切相關，分期越高，miR-133表達量越低(Z=-2.954，P=0.003)；與患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤大小、甲狀腺外浸潤、多灶、淋巴結轉移均無相關性(P>0.05，表3)。

2.3 miR-133對FTC的診斷價值FTC與PTC組中以miR-133相對表達量0.593為臨界值時，AUC為0.719(95%CI：0.591～0.846)，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為81.2%，約登指數(shù)為0.446，見圖1。FTC與結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中以miR-133相對表達量0.725為臨界值時，AUC為0.723(95%CI：0.595～0.852)，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為80.0%，約登指數(shù)為0.433，見圖2。提示miR-133對FTC、PTC及結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤的鑒別均有一定的診斷效能。

表1 甲狀腺癌患者的臨床病理資料

表2 FTC、PTC、結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中miRNA-133的表達

表3 FTC組織中miR-133相對表達與臨床病理特征的關系

圖1 FTC與PTC組中miR-133的ROC曲線

圖2 FTC與結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中miR-133的ROC曲線

3 討論

細針穿刺細胞學活檢(fine needle aspiration, FNA)是術前診斷甲狀腺腫瘤的金標準，術中快速冷凍病理切片是術中病理的主要診斷方法，F(xiàn)TC是具有濾泡細胞分化的惡性腫瘤。FNA因其觀察不到血管及包膜，術中快速冷凍病理切片因制片關系不易明確包膜及血管狀態(tài)，兩種檢查均無法給出FTC的直接診斷，且分化性甲狀腺腫瘤(FTC和濾泡性腺瘤)病理學形態(tài)十分相近，對于FTC和濾泡性腺瘤的鑒別，在日常病理醫(yī)師的診斷中就更加困難[3]。因此，開展一種用于診斷FTC腫瘤標志物的研究具有重要的臨床意義。

小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA[4]。在哺乳動物中，miRNA中的第2～8核苷酸序列與mRNA靶基因的5′末端和3′UTR互補結合，在轉錄后階段調節(jié)靶基因表達。近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中失調的miRNA與其發(fā)病機制和病理學密切相關，miRNA主要參與調控個體發(fā)育、細胞增殖和分化、細胞凋亡、細胞周期調控等生命活動，miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，且可反映腫瘤存在及生長，是潛在的腫瘤標志物(tumor marker, TM)[4]。在甲狀腺癌的研究中，miRNA的表達紊亂亦可通過促進細胞增殖，抑制細胞凋亡及自噬，增強細胞的侵襲和轉移等方面促進甲狀腺癌的發(fā)生及發(fā)展[5]。Chen等[6]最早發(fā)現(xiàn)miR-133可通過抑制血清反應因子(serum response factor, SRF)增強骨骼肌成肌細胞增殖及分化，其存在于果蠅到人類等多個動物物種體內，提示miR-133具有進化的保守性且可能參與機體復雜的分子調節(jié)。研究表明miR-133在乳腺癌[7]、非小細胞肺癌[8]、前列腺癌[9]、膀胱癌[10]、結腸癌[11]、胃癌[12]、肝癌[13]等多種腫瘤中均表達失調，且參與癌細胞的增殖、侵襲。Zhou等[10,14]研究發(fā)現(xiàn)miR-133a可通過靶向與肺癌及膀胱癌細胞中的表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)結合抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Weber等[15]于2006年首次提出miRNAs在FTC中表達異常，miR-197和miR-346的高表達可促進FTC細胞增殖、遷移、侵襲，為FTC的診斷和治療提供可能新的標志物和治療方向。miR-133在FTC中表達情況尚未見報道。本組實驗結果表明，miR-133在FTC細胞中表達下調，且與FTC的高分期具有相關性，提示miR-133在FTC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，但其作用機制尚不清楚。

本組ROC曲線結果顯示，F(xiàn)TC與結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中以miR-133的截斷值為0.725，AUC為0.723，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為80.0%；FTC與PTC組中miR-133的截斷值為0.593，AUC為0.719，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為81.2%。ROC曲線均顯示miR-133作為一種潛在分子標志物對FTC有一定診斷效能，但靈敏度偏低，且本組納入病例數(shù)量較少，未來如進一步行大樣本及FNA標本實驗，并聯(lián)合更多特異的miRNA進行檢測，才有望達到臨床應用標準。

甲狀腺濾泡性腫瘤的診斷目前還是臨床病理診斷的難點，本實驗結果顯示，miR-133在FTC組織中表達下調，且與腫瘤的病理分期具有相關性；ROC曲線進一步表明，miR-133用于鑒別FTC與PTC、結節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤具有一定的診斷價值。限于本組病例數(shù)偏少，仍需擴大樣本量進行深入探究。