乳腺癌化療耐藥與MTDH過表達的關(guān)系及機制分析

張玲芳，方曉露，高媛媛，呂懷盛

乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。目前乳腺癌的治療方法主要包括手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌以及靶向治療，其中化療是治療乳腺癌的主要方式之一，對于術(shù)后和晚期乳腺癌患者常用含紫杉類和(或)蒽環(huán)類化療方案進行治療，然而化療耐藥易使乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。目前認為P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表達升高與多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的產(chǎn)生密切相關(guān)[4]。異黏蛋白(metadherin, MTDH)屬于癌基因蛋白，有研究表明其過表達與乳腺癌的發(fā)生及化療耐藥均密切相關(guān)[5]，其具體機制有待進一步分析。本文著重探討乳腺癌組織中MTDH與P-gp表達的相關(guān)性及MTDH過表達誘導(dǎo)乳腺癌化療耐藥的可能機制，為病理與臨床醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織學(xué)標本 收集2016年1月～2017年12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院病理科存檔的89例乳腺非特殊型浸潤性癌手術(shù)切除標本(其中4例復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移)，患者均為女性，中位年齡52歲。所有病例術(shù)前均未行任何放、化療等抗腫瘤治療，患者術(shù)后均接受至少2個周期的常規(guī)化療。

1.1.2細胞及病毒 人乳腺癌細胞株MCF-7購自上海吉凱公司，LV-MTDH慢病毒(25853-2)和陰性對照病毒CON238由上海吉凱公司設(shè)計合成。

1.1.3主要試劑 細胞培養(yǎng)用胎牛血清購自BI公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。CCK-8試劑盒購自上海東仁公司，Western blot試劑盒購自江蘇凱基公司。免疫組化用抗體MTDH(ZA-0346)和P-gp(ZM-0189 C494)均購自北京中杉金橋公司，Western blot實驗用抗體MTDH(Ab-BF0508)、P-gp(Ab-AF5185)、β-catenin(Ab-AF6266)、p-AKT(Ser473)(AF0016)、AKT(AF6261)、p-GSK-3β(Ser9)(Ab-AF2016)、GSK-3β(Ab-AF5016)和GAPDH(AF7021)均購自Affinity公司。藥物紫杉醇(HY-B0015)和阿霉素(HY-15142)均購自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，行HE和免疫組化SP法染色。一抗為兔抗人MTDH多克隆抗體工作液和鼠抗人P-gp單克隆抗體工作液，以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性標本作陽性對照。MTDH和P-gp以腫瘤細胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)細胞著色強度及陽性細胞百分比進行評估。MTDH按細胞著色強度計分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分率計分：無陽性腫瘤細胞為0分、1%～20%為1分、21%～50%為2分、51%～70%為3分、>70%為4分；將上述兩項得分結(jié)果相乘：≥4為高表達，≤3為低表達。P-gp按細胞著色強度計分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分率計分：無陽性腫瘤細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將上述兩項得分結(jié)果相加，0～1分為(-)，2～3分為(±)，4～5分為(+)，6～7分為()，其中(-)和(±)判為低表達，(+)和()判為高表達。

1.2.2細胞培養(yǎng)與慢病毒感染 MCF-7乳腺癌細胞株用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基置入37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代、培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MCF-7常規(guī)消化，調(diào)整細胞數(shù)為每毫升5×104個細胞，接種于6孔板，每孔2 mL細胞懸液。設(shè)置3個組：空白對照組、陰性對照組和MTDH過表達組。待細胞貼壁后，空白對照組加入1 mL完全培養(yǎng)基，陰性對照組和MTDH過表達組以MOI=50加入相對應(yīng)的慢病毒液感染24 h。感染后72 h加入1 μg/mL嘌呤霉素對陰性對照組和MTDH過表達組細胞進行穩(wěn)定株篩選，同時收集各組細胞進行Western blot檢測，結(jié)果穩(wěn)定后將鑒定結(jié)果正常的細胞凍存，進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8實驗 將培養(yǎng)的陰性對照組和MTDH過表達組細胞按每毫升10×104個細胞的密度接種于96孔板，接種體積每孔100 μL。待細胞貼壁后，向96孔板中加入濃度為1 μmol/mL的紫杉醇或1 μmol/mL阿霉素處理細胞48 h，取出96孔板小心吸棄96孔板中含藥物的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8液，放入細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后用酶標儀測定450 nm處吸光度，計算藥物的抑制率[抑制率=(對照孔-實驗孔)/(對照孔-空白孔)]。

1.2.4Western blot法 收集空白對照組、陰性對照組和MTDH過表達組細胞，提取各組細胞總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度，制備8%SDS-PAGE凝膠，每泳道上樣50 μg/10 μL對蛋白樣品進行電泳分離，分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光法顯色后，用Image J軟件進行分析，以目的條帶灰度值與對應(yīng)泳道GAPDH灰度值的比值表示各樣本蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩獨立樣本間均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩個樣本率間比較采用四格表資料的χ2檢驗，多個樣本率間比較采用行×列表資料的χ2檢驗，采用Spearman秩相關(guān)對兩等級數(shù)據(jù)變量進行分析。每個實驗至少重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中MTDH的表達MTDH蛋白陽性呈棕色或棕黃色顆粒，主要定位于腫瘤細胞胞質(zhì)或胞膜(圖1)。MTDH在乳腺癌和癌旁組織中的高表達率分別為97.8%和25.8%，乳腺癌中MTDH高表達率明顯高于癌旁組織(P<0.01，表1)。

ABCD

表1 乳腺癌和癌旁組織中MTDH的表達[n(%)]

2.2 乳腺癌中MTDH和P-gp蛋白表達的相關(guān)性MTDH和P-gp蛋白均高表達59例，均低表達0例，僅MTDH高表達28例，僅P-gp高表達2例。相關(guān)分析結(jié)果顯示，MTDH表達水平隨P-gp表達的增高而增高，兩者在乳腺癌中的表達呈顯著正相關(guān)(rs=0.568，P<0.01，表2)。

表2 乳腺癌中MTDH和P-gp蛋白表達的相關(guān)性

2.3 過表達MTDH的MCF-7乳腺癌細胞對紫衫醇和阿霉素耐受性的影響經(jīng)1 μmol/mL紫杉醇或1 μmol/mL阿霉素分別處理MCF-7乳腺癌細胞48 h后，與陰性對照組相比，MTDH過表達組對紫衫醇和阿霉素的敏感性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。表明MTDH過表達可明顯提高MCF-7乳腺癌細胞對紫衫醇和阿霉素的耐受性。

圖2 CCK-8實驗檢測過表達MTDH的MCF-7乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素敏感性的影響

2.4 MTDH過表達對MCF-7乳腺癌細胞P-gp表達的影響MTDH過表達組中P-gp蛋白表達水平明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。表明在MCF-7乳腺癌細胞中MTDH過表達可引起耐藥蛋白P-gp過表達。

2.5 MTDH過表達對MCF-7乳腺癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響MTDH過表達組中β-catenin蛋白水平升高，p-AKT(Ser473)及p-GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。表明在MCF-7乳腺癌細胞中MTDH過表達激活Wnt/β-catenin信號通路。

圖3 Western blot法檢測MTDH過表達對MCF-7乳腺癌細胞P-gp的影響

圖4 Western blot法檢測MTDH過表達對MCF-7乳腺癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

化療耐藥的產(chǎn)生是乳腺癌治療過程中長期以來面臨的難題，其影響乳腺癌患者的治療效果，因此乳腺癌化療耐藥的機制研究一直是眾多學(xué)者的研究熱點[6]。MTDH(又名AEG-1、LYRIC或3D3)是近年來發(fā)現(xiàn)的癌基因，人類MTDH基因定位于8q22染色體上，該區(qū)域存在與許多癌癥發(fā)生相關(guān)的擴增和突變，且與不良預(yù)后有關(guān)[7]。MTDH參與PI3K/AKT、NF-κB和MAPK等信號通路，促進腫瘤的異常增殖、侵襲、血管生成、遠處轉(zhuǎn)移和化療耐藥等[8]。MTDH在大多數(shù)正常人乳腺組織中表達水平較低甚至缺乏，但其在乳腺癌中的表達水平則增高[9]。本組實驗結(jié)果顯示，MDTH在乳腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織中均表達，在乳腺癌和癌旁組織中的高表達率分別為97.8%和25.8%，癌組織中MTDH的高表達率明顯高于癌旁組織，與文獻報道MTDH在乳腺癌中的高表達結(jié)果一致[9]，提示MTDH高表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示，乳腺癌中MTDH過表達與TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移和低生存率有關(guān)[9]。本實驗收集乳腺癌病理類型均為浸潤性非特殊癌，病理類型太過單一，致使MTDH高表達率過高無法統(tǒng)計MTDH高表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

MDR是目前腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的重要細胞防御機制，P-gp是常見的MDR蛋白，其過表達是腫瘤產(chǎn)生耐藥的重要原因之一[4]。P-gp具有膜的藥泵作用，既可減少藥物流入，也能主動將進入腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物泵出，使腫瘤細胞內(nèi)抗癌藥物蓄積減少，從而產(chǎn)生耐藥性[4]，其轉(zhuǎn)運的藥物通常為大分子量的親脂性化合物，包括治療乳腺癌常用的化療藥紫杉醇和阿霉素。有研究顯示，在肝癌中MTDH可以通過增加P-gp表達增加阿霉素的外排，減少阿霉素在細胞內(nèi)的積累，從而促進阿霉素的耐藥[10]。在乳腺癌中，有研究者采用shRNA干擾技術(shù)沉默了乳腺癌細胞MCF-7/ADM中MTDH基因，結(jié)果表明沉默MTDH基因可以通過促進乳腺癌細胞MCF-7/ADM凋亡和降低P-gp蛋白表達，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞MCF-7/ADM對阿霉素的耐藥性[11]。為進一步探討MTDH過表達引起的乳腺癌化療耐藥與耐藥蛋白P-gp的關(guān)系，本實驗檢測了MTDH和P-gp蛋白在89例乳腺癌組織中表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示MTDH與P-gp的表達呈正相關(guān)，采用慢病毒感染的方法在乳腺癌細胞MCF-7中過表達MTDH，引起了P-gp蛋白表達增高，并且提高了乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素的耐受性，提示MTDH過表達可能是通過增加P-gp蛋白表達引起乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性。

有文獻報道PI3K/AKT和NF-κB信號通路與MTDH引起的乳腺癌化療耐藥有關(guān)[10，12]，但與Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)性少有報道。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、分化的一個重要途徑，是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控機制[13]。2007年Woodward等[14]報道原代小鼠乳腺上皮祖細胞對輻射具有抵抗性，并且這種抗性是由β-catenin信號通路介導(dǎo)，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在乳腺癌放療抵抗中發(fā)揮一定的作用。本實驗探索了MTDH過表達引起的乳腺癌化療耐藥與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系，結(jié)果顯示MTDH過表達使β-catenin蛋白表達增加，p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平增高，提示MTDH過表達引起的乳腺癌化療耐藥可能由Wnt/β-catenin信號通路來介導(dǎo)，通過MTDH/AKT/GSK-3β信號軸，MTDH控制β-catenin的磷酸化水平，使得P-gp蛋白表達增高，從而引起乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性。

綜上所述，MTDH和P-gp在乳腺癌中均高表達，其與乳腺癌的化療耐藥密切相關(guān)。在MCF-7乳腺癌細胞中過表達MTDH，可以引起P-gp蛋白表達升高及Wnt/β-catenin信號通路的活化，從而使得乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素的耐受性增加，這可能是MTDH過表達導(dǎo)致乳腺癌化療耐藥的機制之一，但仍需更進一步分析。