黃芩中黃芩新素提取制備工藝優(yōu)化的研究

黃雪雪，陳 莉，林珠燦，余麗雙

黃芩中黃芩新素提取制備工藝優(yōu)化的研究

黃雪雪，陳 莉，林珠燦，*余麗雙

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建，福州 350122）

為建立制備大量高純度黃芩新素的方法。比較了超聲法和回流提取法提取黃芩中黃芩新素，及不同萃取溶劑對黃芩中黃芩新素得率的影響，通過HPLC色譜法測定黃芩新素的含量，并用LC-8A高壓制備色譜儀制備黃芩新素。采用回流提取法及使用乙醚作為萃取溶劑時，黃芩新素得率最高，制備的黃芩新素純度可達到97.96%。本實驗建立的方法操作簡便，重現(xiàn)性好，制備的黃芩新素純度符合對照品純度的要求。

黃芩；黃芩新素；HPLC

黃芩為唇形科 (Labiatae) 植物黃芩屬 (Scutellaria) 多年生草本植物，以干燥根入藥[1]。作為傳統(tǒng)的藥用植物，黃芩在我國已有數(shù)千年的藥用歷史，具有抗菌抗病毒、抗過敏、抗腫瘤、保護心血管、清熱燥濕、瀉火解毒等功效[2~5]。黃芩的成分眾多，其主要活性成分是黃酮類，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等。此外，黃芩還含有萜類、氨基酸、甾醇、揮發(fā)油、多糖、微量元素等其他成分[6]。目前對黃芩有效成分的研究多集中在黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等含量較高的黃酮類成分，國內(nèi)外對于黃芩新素的研究較少，但是近年來有研究發(fā)現(xiàn)黃芩新素也有較強的藥理作用。

黃芩新素（Neobaicalein或Scutellaria baicalensis flavone II）是黃芩中的重要生物活性成分之一，具有抑制細胞增殖及抗炎活性。黃芩新素在前列腺癌和白血病細胞中表現(xiàn)出較強的抑制活性，實驗表明其在黃芩提取物中是促使白血病細胞HL-60和K562凋亡的主要活性成分[7]。黃芩新素通過下調(diào)miR-21表達，上調(diào)PP2A表達然后使PI3K / AKT / mTOR信號通路失活來對肺癌細胞發(fā)揮抗癌作用[8]。實驗表明，口服黃芩的大鼠含藥血清中，黃芩新素是具有HepG2結(jié)合與抑制作用的活性成分之一[9]。黃芩新素活性雖不如黃芩苷及黃芩素強，但是有研究發(fā)現(xiàn)黃芩新素能特異性結(jié)合在腫瘤生長和免疫抑制中起重要作用的STAT3靶蛋白[10]，這為治療癌癥提供了新思路。黃芩新素具有抗炎、抗腫瘤活性，但是由于其在黃芩中含量非常少，目前對黃芩新素的提取制備沒有明確系統(tǒng)的方法。近年來研究黃芩新素藥理作用的學者越來越多，可見從黃芩中提取制備高純度黃芩新素的工作特別重要。為制備大量高純度黃芩新素以供后續(xù)實驗使用，本研究實驗通過對比提取方法及萃取溶劑，以求找到提取制備黃芩新素的最佳實驗條件，通過高壓制備色譜儀能簡單、快速制備出大量高純度的黃芩新素。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷（分析純，西隴化工股份有限公司）；甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），黃芩新素（上海源葉生物科技有限公司）黃芩藥材（購自閩侯縣上街致誠醫(yī)藥商店）。

1.2 實驗儀器

戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀，LC-8A高壓制備色譜儀（Shimadzu），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18(250 mm×4.6 mm)，流動相：甲醇-水（60:40），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃；進樣量：對照品10 μL，供試品1 μL；檢測波長：270 nm[11]。

2.2 提取物的制備

2.2.1 標準品的制備

精密稱取黃芩新素對照品1 mg，用甲醇配置成1 mg/mL的母液，之后再用甲醇稀釋至所需濃度使用，按照“2.1”項下色譜條件進行分析。

2.2.2 藥材的預(yù)處理

稱取干燥的黃芩藥材適量，粉碎至細粉，過40目篩后分裝樣品袋中，備用。

2.2.3提取方法的比較

超聲法：稱取黃芩粉末200.82 g，用95%的乙醇按料液比1:8 (m/v) 于圓底燒瓶中浸泡過夜。30 ℃條件下超聲提取3次，提取功率400 W，每次超聲30 min。紗布過濾后，將三次濾液混合后減壓濃縮至浸膏狀，用100 mL超純水分散黃芩浸膏，用100 mL乙醚進行萃取，重復(fù)3次。將三次萃取溶液減壓濃縮后用50 mL甲醇復(fù)溶，溶液過0.22 μm濾膜后按照“2.1”項下色譜條件進行分析。

回流提取法：稱取黃芩粉末202.04 g，用95%的乙醇按料液比1:8 (m/v) 于圓底燒瓶中浸泡過夜，加熱回流1 h后濾渣繼續(xù)用95%的乙醇按料液比1:8 (m/v) 加熱回流1 h，重復(fù)2次。紗布過濾后，合并3次提取液，減壓濃縮至浸膏狀。浸膏用100 mL超純水分散黃芩浸膏，用100 mL乙醚萃取3次，合并乙醚層溶液，減壓濃縮后用50 mL甲醇復(fù)溶，溶液過0.22 μm濾膜后按照“2.1”項下色譜條件進行分析。通過HPLC色譜分析黃芩新素得率[12]。

兩種方法所得結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明回流提取法的得率高于超聲法，故采用回流提取法提取黃芩新素。

表1 不同提取工藝下黃芩新素得率

2.2.4 萃取溶劑的選擇

將“2.2.3”項下回流提取法得到的黃芩浸膏用100 mL超純水分散之后，分別用乙醚、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷各100 mL進行萃取，重復(fù)操作3次，合并3次萃取液減壓濃縮后加入50 mL甲醇復(fù)溶，溶液過0.22 μm濾膜后按照“2.1”項下色譜條件進行分析。各萃取劑對黃芩新素分離提取情況如表2及圖1所示。表2中，當用二氯甲烷萃取黃芩浸膏時，黃芩新素因為未與前一個峰分離開來，故未能計算其含量。結(jié)合圖1及表2可以看出，當用乙醚萃取黃芩浸膏時，HPLC測得的黃芩新素的含量最高，且分離度達到2.99，符合完全分離的要求，故選擇乙醚作為制備黃芩新素的萃取溶劑。

A.黃芩新素對照品 B.二氯甲烷提取物 C.石油醚提取物 D.乙醚提取物 E.乙酸乙酯1.黃芩新素

表2 不同溶劑提取分離黃芩新素結(jié)果

2.2.5 黃芩新素的分離制備

將回流提取法得到的提取液經(jīng)乙醚萃取后，再經(jīng)甲醇復(fù)溶的溶液在LC-8A高壓制備色譜儀上進行制備，流動相為甲醇-水（60:40），流速為5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為270 nm，進樣量為1.2 mL。其分離制備圖譜如圖2所示，可以看出黃芩新素在13.5 min左右出峰，持續(xù)時間1 min左右，與黃芩新素對照品HPLC譜圖基本一致，表明該制備方法可行。將收集的流分濃縮干燥后得黃色粉末狀固體，即為制備后的黃芩新素。精密稱定一定量的制備黃芩新素，用甲醇溶解稀釋成83.3 μg/mL的溶液，按照“2.1”項下的進樣條件進行HPLC分析。制備黃芩新素HPLC色譜圖如圖3所示。經(jīng)HPLC分析其純度為97.96%。

圖2 制備分離黃芩新素色譜圖

圖3 制備后的黃芩新素HPLC色譜圖

2.3 黃芩中提取分離黃芩新素工藝路線圖

圖4 工藝路線圖

3 討論

本實驗以中藥黃芩中的黃芩新素為研究對象，胡碧煌等[13]從滇黃芩中分離出一種結(jié)構(gòu)式為（2S）-2′,5,6′-三羥基-7-甲氧基雙氫黃酮的新型化合物，命名為黃芩新素Ⅰ，之后又分離鑒定出黃芩新素Ⅱ，為后續(xù)研究黃芩新素藥理作用提供試藥。本實驗前期優(yōu)化了黃芩新素提取方法，比較了超聲波法和回流提取法對黃芩新素得率的影響。超聲波提取法利用超聲波輔助溶劑進行提取，破壞植物藥材的細胞，使溶劑滲透到藥材細胞中，從而縮短提取時間，提高提取率；回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取原料成分，使揮發(fā)性溶劑不斷地餾出后又被冷卻，重復(fù)流回浸出容器中浸提原料，直至有效成分回流提取完全的方法。兩者各有其優(yōu)缺點。從實驗結(jié)果可以看出超聲法操作簡單，但回流提取法的得率更高，表明相較于超聲法，回流提取法能更有效地提取黃芩新素。

鑒于黃芩新素在黃芩中含量較低，本實驗采取LC-8A高壓制備色譜儀進行大量提取制備。從中藥復(fù)雜成分中分離出某一單一成分，傳統(tǒng)方法多采用超離心、沉淀、萃取、超濾等分離技術(shù)[14]，這些方法往往耗時且達不到所需純度。高壓制備色譜技術(shù)應(yīng)用于中藥復(fù)雜成分分離、提取和純化，所得純度基本能達到對照品要求。與傳統(tǒng)方法相比，其效率高、餾分損失少、樣品回收率高，是目前中藥復(fù)雜成分分離、提取、純化的重要手段。本實驗所提取制備的黃芩新素純度達到97.96%，符合純度的要求。實驗結(jié)果表明本法操作簡便，重現(xiàn)性好，所得純度高。

本實驗比較了不同的提取方法、萃取溶劑對黃芩中黃芩新素提取率及分離度的影響，最后發(fā)現(xiàn)采用回流提取法，用乙醚作為萃取溶劑，采用甲醇-水（60:40）為流動相時黃芩新素的含量及分離度最佳。

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OPTIMIZATION OF EXTRACTION AND PREPARATION PROCESS OF NEOBAICALEIN IN

HUANG Xue-xue, CHEN Li, LIN Zhu-can,*YU Li-shuang

(College of pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China)

To establish a method for preparing a large amount ofhigh-purity neobaicalein.The extraction of neobaicalein fromby ultrasonic method and reflux extraction method were compared, and the effect of different extraction solvents on the yield of neobaicalein fromwas investigated. The content of neobaicalein was determined by HPLC, and neobaicalein was prepared by LC-8A high-pressure preparative chromatograph.When reflux extraction was adopted and ether were used as extraction solvent, the yield of neobaicalein was the highest , and the purity of neobaicalein was 97.96%.The method established in this experiment is easy to operate and has good reproducibility. And the purity of the prepared neobaicalein mets the requirements of the reference substance.

; neobaicalein; HPLC

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.04.017

1674-8085(2020)04-0091-04

2020-03-06；

2020-04-27

國家自然科學基金項目（81903855）；福建省科技廳計劃項目（2017Y0050，2018J01871）

黃雪雪(1995-)，女，河南信陽人，碩士生，主要從事中藥分析方法學研究(E-mail：1533628588@qq.com);

陳 莉(1980-)，女，福建福州人，副教授，主要從事中藥質(zhì)量控制研究(E-mail：Shirley_chli@163.com);

林珠燦(1980-)，男，福建莆田人，副教授，主要從事中藥化學研究(E-mail：569324051@qq.com);

*余麗雙(1982-)，女，福建莆田人，副研究員，博士，碩士生導師，主要從事中藥質(zhì)量控制研究(E-mail: sly2018@126.com).