HPLC法研究三種皮類藥材不同貯藏期藥效成分的含量變化

武繼斌，郭玉潔，李少彤，趙麗娟，褚洪標(biāo)，梁兆昌

HPLC法研究三種皮類藥材不同貯藏期藥效成分的含量變化

武繼斌，郭玉潔，李少彤，趙麗娟，*褚洪標(biāo)，梁兆昌

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009)

利用高效液相色譜法探究杜仲、厚樸和黃柏三種皮類藥材不同貯藏期藥效成分的含量變化。分別采用回流、超聲和閃式三種方式對同批貯存一年以及貯存五年的杜仲、厚樸和黃柏三種皮類藥材進行提取，并利用高效液相色譜法對提取液中有效成分進行定量分析。與貯藏期一年的藥材相比，經(jīng)過5年的貯存，三種皮類藥材的藥效物質(zhì)含量均隨著貯藏期延長或多或少的降低，其中杜仲皮中桃葉珊瑚苷的含量減少70 %以上；厚樸皮中厚樸酚及和厚樸酚的含量減少1 %以下；黃柏皮中鹽酸小檗堿的含量減少10 %以上。三種皮類藥材的藥效物質(zhì)在貯藏期變化總體有相似的規(guī)律，貯藏時間對杜仲皮皮中桃葉珊瑚苷的含量影響較大，對厚樸皮中厚樸酚與和厚樸酚的含量影響最小，而對黃柏皮中鹽酸小檗堿的含量影響較小。研究結(jié)果為三種皮類藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

杜仲；桃葉珊瑚苷；厚樸；厚樸酚；和厚樸酚；黃柏；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

中藥材是季節(jié)性、地域性生產(chǎn)的藥品，貯藏是中藥材流通使用過程中的一個重要環(huán)節(jié)。貯藏年限對藥材質(zhì)量的影響，不僅關(guān)系到藥材的使用，而且影響藥材的生產(chǎn)、經(jīng)營[1-2]。如果一種藥材耐貯藏性好，其生產(chǎn)、經(jīng)營、使用的風(fēng)險就小。

杜仲、厚樸、黃柏（簡稱三木）屬木本皮類藥材，都是用途廣泛的中藥材，其資源豐富，在醫(yī)學(xué)上具有重要的臨床使用價值。中藥材中所指杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，是中國名貴滋補藥材，含有桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、黃酮等多種成分，具有降壓、利尿等作用，在臨床上常用于補肝腎、強筋骨、安胎、高血壓等多種癥狀[3-4]。厚樸是木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸的樹皮，主要活性成分厚樸酚與和厚樸酚具有抗菌、抗?jié)兗胺例x等作用，《中國藥典》將其作為厚樸質(zhì)量的主要控制標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。黃柏是蕓香科植物黃柏或黃皮樹的樹皮，含有小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、掌葉防己堿等多種生物堿，常用于清熱、燥濕、瀉火、解毒、熱痢、黃疸等多種癥狀[7-8]。

藥材貯藏期間的質(zhì)量變化，其關(guān)鍵因素是由藥材特性決定的, 不同來源的藥材具有不同的特性。由于皮類藥材具有相似的特性，本研究通過對不同貯藏期的杜仲、厚樸、黃柏等三種皮類藥材進行取樣，測定其藥用有效成分，分析不同貯藏期對藥材質(zhì)量有無影響，從而為杜仲、厚樸、黃柏提供合理、科學(xué)的貯藏依據(jù)，便于指導(dǎo)臨床用藥。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-A循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DG-160中藥粉碎機（瑞安飛達藥材器械廠）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；SL-250型超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；ZHBE-50閃式提取器（河南智晶生物科技發(fā)展有限公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢測器）。

1.2 試藥

杜仲、厚樸和黃柏樣品于 2014 年 8 月采集于江西省井岡山，自然風(fēng)干，由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室梁兆昌教授鑒定為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides）的干燥樹皮、木蘭科植物厚樸( Magnolia officinalis) 的干燥樹皮、蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense）的干燥樹皮。對照品桃葉珊瑚苷（南京草本源生物科技有限公司，批號479-98-1）、厚樸酚 (中國食品藥品檢定研究院，批號110729-200412 )、和厚樸酚(中國食品藥品檢定研究院，批號 110730-201313)、鹽酸小檗堿（北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號633-65-8）；甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 超聲提取供試品溶液

精密稱取杜仲、厚樸、黃柏藥材粉末各10 g，包括貯藏期1年期樣品（于2015年8月樣品含量測定）和貯藏期5年期樣品（于2019年8月樣品含量測定），置錐形瓶中，精密加甲醇 100 mL，封口，于超聲提取器（功率120 W，頻率40 kHz）中超聲處理30 min，取出，過濾，收集濾液；藥渣重復(fù)上述步驟再提取1次，過濾，合并濾液，定容至200 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液。

2.1.2 回流提取供試品溶液

精密稱取杜仲、厚樸、黃柏藥材粉末各10 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，精密加甲醇 100 mL，于恒溫水浴鍋中 100 ℃回流 60 min，取出，放冷，過濾，收集濾液；藥渣重復(fù)上述步驟再提取1次，過濾，合并濾液，定容至200 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液。

2.1.3 閃式提取供試品溶液

精密稱取杜仲、厚樸、黃柏藥材粉末各10 g，置于500 mL 圓筒中，加入甲醇 100 mL，設(shè)置閃式提取器工作電壓為50 V，提取時間 10 min，過濾，收集濾液；藥渣重復(fù)上述步驟再提取1次，過濾，合并兩次濾液，定容至 200 mL，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過，收集濾液。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 桃葉珊瑚苷對照品溶液的制備

精密稱取桃葉珊瑚苷對照品 3.0 mg 置于 10 mL 容量瓶中，按流動相比例加甲醇和水至刻度線，搖勻，得到對照品溶液濃度為 0.3 mg/mL。

2.2.2 厚樸酚與和厚樸酚對照品溶液的制備

分別精密稱取厚樸酚與和厚樸酚對照品 15.8 mg和7.0 mg，分別置于 10 mL 容量瓶中，按流動相比例加甲醇和水至刻度線，搖勻，得到對照品溶液濃度為 1.58 mg/mL和0.7 mg/mL。

2.2.3 鹽酸小檗堿對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品10 mg置于10 mL容量瓶中，按流動相比例加乙腈和磷酸溶液至刻度線，搖勻，得到對照品溶液濃度為 1 mg/mL。

2.3 色譜條件

杜仲的色譜條件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（5:95）；檢測波長 203 nm；流速 1 mL / min；柱溫 25℃；進樣量 10 μL。厚樸的色譜條件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75:25）；流速1 mL/min；檢測波長294 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。黃柏的色譜條件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50:50，含0.1%的十二烷基硫酸鈉）；流速1 mL/min；檢測波長265 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項配制的桃葉珊瑚苷對照品儲備液，加適量流動相分別配制成以下6個濃度梯度的對照品溶液：300.00、150.00、75.00、37.50、18.75、9.375 μg/mL。在“2.3”條件下，分別測定其峰面積。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y = 7.2963X + 77.159（r = 0.9995），在9.375 ~ 300.00 μg / mL 范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

取“2.2.2”項配制的厚樸酚與和厚樸酚對照品儲備液，加適量流動相分別配制成以下6個濃度梯度的對照品溶液：1580.00、790.00、355.00、197.5.00、98.75、49.375 μg/mL和700.00、350.00、175.00、87.50、43.75、21.375 μg/mL。在“2.3”條件下，分別測定其峰面積。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y = 8.6628X - 97.793 （r = 0.9995）和Y = 9.4198X + 159.15（r = 0.9996）。厚樸酚與和厚樸酚分別在49.375~580.00 μg/mL和21.375 ~700.00 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

取“2.2.3”項配制的鹽酸小檗堿對照品儲備液，加適量流動相分別配制成以下6個濃度梯度的對照品溶液：1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL，在“2.3”條件下，分別測定其峰面積。以濃度（μg / mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y = 26.463X + 164.17（r = 0.9996），在31.25~1000.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度實驗

取含桃葉珊瑚苷 75.00 μg/mL 的對照品溶液，在“2.3”色譜條件下連續(xù)進樣 5 次，測定峰面積，求得桃葉珊瑚苷的RSD（n = 5）0.9 %，表明精密度良好。取含厚樸酚與和厚樸酚355.00 和175.00 μg/mL 的對照品溶液，在“2.3”色譜條件下連續(xù)進樣 5 次，測定峰面積，求得厚樸酚的RSD（n = 5）為0.8 %，和厚樸酚的RSD（n = 5）為0.2 %，表明精密度良好。取含鹽酸小檗堿250.00 μg/mL 的對照品溶液，在“2.3”色譜條件下連續(xù)進樣 5 次，測定峰面積，求得鹽酸小檗堿的RSD（n = 5）為 0.6 %，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

分別取同一杜仲、厚樸和黃柏供試品分別于 0，2，4，6，8，10 h 時，在“2.3”項條件下進樣，測定峰面積，求得桃葉珊瑚苷、厚樸酚、和厚樸酚、鹽酸小檗堿的RSD（n = 5）分別為0.9 %、0.6 %、0.2 % 和1.1 %，說明待測組分在 12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.4 重復(fù)性實驗

分別稱取杜仲、厚樸和黃柏粉末各5份，每份10 g，按照“2.1”項下方法制得供試品溶液，分別在“2.3”項條件下進樣，測定峰面積。求得桃葉珊瑚苷、厚樸酚、和厚樸酚、鹽酸小檗堿RSD分別為0.5 %、0.4 %、0.5 % 和0.3 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗

分別稱取杜仲、厚樸和黃柏粉末各5份，每份10 g，分別加入一定量的桃葉珊瑚苷、厚樸酚、和厚樸酚、鹽酸小檗堿對照品，按照“2.1”項方法操作提取，制得供試品溶液，分別在“2.3”項條件下進樣，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷、厚樸酚、和厚樸酚、鹽酸小檗堿平均回收率為 97.4 %、98.9 %、98.1 %、97.6 %，其 RSD 分別為2.3 %、1.7 %、1.9 %、2.0 %。

3　結(jié)果

3.1 杜仲樣品測定

按照“2.1.1”項方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定。對照品桃葉珊瑚苷（aucubin）及供試品的HPLC 圖譜見圖 1。利用峰面積，由線性方程計算得到 aucubin的含量，實驗結(jié)果見表1。

圖1 杜仲皮桃葉珊瑚苷（aucubin）對照品（A）和供試品（B）的HPLC色譜圖

表1 杜仲皮不同貯藏期桃葉珊瑚苷的含量變化

中藥常用的提取方法有超聲提取和回流提取等方法，可以很好地表現(xiàn)出各種藥材中有效成分的含量，而閃式提取也是近年發(fā)展的先進方法，本次實驗采用上述三種方式對藥材進行提取。杜仲皮中桃葉珊瑚苷，其中水浴加熱回流提取中含量差為每10g藥材差21.009 mg，減少的比重為74.957%；超聲提取中含量差為每10 g藥材差21.212 mg，減少的比重為72.846%；閃式提取中含量差為每10g藥材25.790 mg，減少的比重為75.546%，三種不同的提取方式得到的桃葉珊瑚苷的比重變化差異不大。上述實驗數(shù)據(jù)顯示貯藏時間對桃葉珊瑚苷的含量有較大影響，貯藏時間為5年的杜仲皮中桃葉珊瑚苷含量明顯低于當(dāng)年期杜仲皮中桃葉珊瑚苷含量。實驗結(jié)果表明，如要利用杜仲皮中的活性成分桃葉珊瑚苷，需注意貯藏時間對其藥效的影響。

3.2 厚樸樣品測定

按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定。對照品厚樸酚(magnolol)、和厚樸酚(honokiol) 及供試品HPLC圖譜見圖2。利用峰面積，由線性方程計算得到magnolol、honokiol的含量，實驗結(jié)果見表2和表3。

圖2 厚樸皮厚樸酚( magnolol)（A）、和厚樸酚( honokiol)（B）對照品及供試品（C）HPLC色譜圖

表2 厚樸皮不同貯藏期厚樸酚的含量變化

表3 厚樸皮不同貯藏期和厚樸酚的含量變化

本次實驗用三種方式提取厚樸皮中厚樸酚與和厚樸酚，其中水浴加熱回流提取中厚樸酚與和厚樸酚含量差為每10 g藥材分別為1.180 mg和0.371 mg，減少的比重分別為0.004%和0.001%；超聲提取中厚樸酚與和厚樸酚含量差分別為每10g藥材分別為5.725 mg和6.683 mg，減少的比重分別為0.020% 和0.028%；閃式提取中厚樸酚與和厚樸酚含量差分別為每10g藥材分別為3.986 mg和2.001 mg，減少的比重分別為0.013% 和0.008%。對比數(shù)據(jù)得出貯藏時間對厚樸酚與和厚樸酚的含量影響較小，貯藏時間為5年的樹皮中厚樸酚和和厚樸酚的含量與當(dāng)年期樹皮中厚樸酚與和厚樸酚的含量變化不大。如要利用厚樸皮中的厚樸酚和和厚樸酚，貯藏時間對其藥效影響不大。

3.3 黃柏樣品測定

按照“2.1.3”項方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定。對照品鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）及供試品的HPLC 圖譜見圖 3。利用峰面積，由線性方程計算得到 berberine hydrochloride的含量，實驗結(jié)果見表4。

圖3 黃柏皮鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)對照品（A）及供試品（B）HPLC色譜圖

表4 黃柏皮不同貯藏期鹽酸小檗堿的含量變化

本次實驗用三種方式提取黃柏皮中鹽酸小檗堿，其中水浴加熱回流提取中含量差為每10 g藥材差62.445 mg，減少的比重為13.037 %；超聲提取中含量差為每10 g藥材差51.933 mg，減少的比重為10.217 %；閃式提取中含量差為每10 g藥材69.957 mg減少的比重為14.317 %。對比數(shù)據(jù)得出貯藏時間對鹽酸小檗堿的含量有一定影響，貯藏時間為5年的樹皮中鹽酸小檗堿含量低于當(dāng)年期樹皮中鹽酸小檗堿含量。如要利用黃柏皮中的鹽酸小檗堿，需注意貯藏時間對其藥效的影響。

目前的研究以杜仲、厚樸和黃柏三種皮類藥材作為對象，利用三種方式提取藥材中的主要活性成分，比較同一藥材貯藏期1年與5年活性成分的含量變化。統(tǒng)計分析實驗結(jié)果，與貯藏期1年的藥材相比，經(jīng)過5年的貯存，三種皮類藥材的藥效物質(zhì)含量均隨著貯藏期延長或多或少的降低，其中杜仲皮中桃葉珊瑚苷的含量減少70%以上；厚樸皮中厚樸酚及和厚樸酚的含量減少1%以下；黃柏皮中鹽酸小檗堿的含量減少10%以上。

4 討論

有關(guān)文獻[9-14]報道表明，中藥常用的提取方法有超聲提取和回流提取等方法，可以很好地表現(xiàn)出各種藥材中有效成分的含量。也可采用傳統(tǒng)浸泡法提取，但是提取工藝繁瑣，費時費力，且提取率不高。近幾年發(fā)展的閃式提取法由于具有快速、完全、高效等特點，得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用[15]。因此，本實驗采用超聲、回流和閃式提取三種方法，對三種皮類藥材進行提取并測定其含量。從三種藥材有效成分的提取方法來看，超聲提取、回流提取及閃式提取比較，有效成分的含量無顯著性差異。

關(guān)于天然藥物中桃葉珊瑚苷、厚樸酚、和厚樸酚及鹽酸小檗堿含量測定的色譜條件不一。本實驗在借鑒前期三種皮類藥材含量測定色譜條件基礎(chǔ)上，結(jié)合前期研究方法[16-17]，采用前述的色譜分析條件，實驗結(jié)果表明在上述色譜條件峰形對稱性較高，無拖尾現(xiàn)象，且其與其他成分分離度、重現(xiàn)性好，三種皮類藥材供試品在測定時均取得了較好的效果。

研究表明，杜仲中桃葉珊瑚苷隨著貯藏期的延長，其含量下降明顯，與其本身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性關(guān)系密切。桃葉珊瑚苷屬于環(huán)烯醚萜類成分，該類型成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。對于厚樸和黃柏二種皮類藥材，由于其主要活性成分厚樸酚、和厚樸酚及鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，隨著貯藏時間的延長，其含量并沒有發(fā)生很多的變化。中藥活性成分復(fù)雜多樣，不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同，針對同一中藥中不同類型藥效物質(zhì)變化不盡不同。即使針對同一中藥中的同一物質(zhì)，由于各地氣候條件不同，對其含量的影響也呈現(xiàn)出差異。目前對中藥貯藏期的研究相對單一，僅對中藥某一指標(biāo)成分進行研究，而沒有對中藥藥效物質(zhì)的整體性綜合研究；中藥在貯藏過程中藥效物質(zhì)發(fā)生變化，其臨床療效是否也受到影響也需要進一步深入研究[18]。因此在以后的研究中，應(yīng)結(jié)合中藥中藥效物質(zhì)自身性質(zhì)與貯藏條件，闡明貯藏機理，明確中藥貯藏期限，科學(xué)合理地貯藏養(yǎng)護中藥，確保臨床用藥安全。同時可以根據(jù)不同的臨床需求選擇不同貯藏期中藥，綜合利用中藥資源。

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CONTENT VARIATION OF PHARMACODYNAMICS COMPONENTS IN THREE CORTEX HERBS UNDER DIFFERENT STORAGE PERIODS BY HPLC

WU Ji-bin, GUO Yu-jie, LI Shao-tong, ZHAO Li-juan,*CHU Hong-biao, LIANG Zhao-chang

(School of Medicine, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi 343009, China)

To determine the optimal storage periods of,, and, the content variation of the pharmacodynamics components in three cortex herbs under different storage periods was tested by HPLC.The methanol extracts of three cortex herbs from same batch of samples of one-year and five-year storage periods were obtained by reflux, ultrasonic, and smashing tissue extraction technology and the contents of pharmacodynamics components were determined by HPLC.After five years storage periods, there was a significant decrease in the contents of aucubin in;there was no significant difference in the contents of magnolol and honokiol in; however, there was a significant increase in the contents of berberine hydrochloride in, respectively.The storage time has a great influence on the contents of aucubin in, a little influence on the contents of magnolol and honokiol in, and berberine hydrochloride in. The study might provide a scientific basis for the quality control of three cortex herbs.

; aucubin;; magnolol; honokiol;; berberine hydrochloride; HPLC

R917/R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.04.016

1674-8085(2020)04-0083-08

2020-03-06；

2020-04-17

江西省教育廳科技計劃項目(GJJ150769)；全國中藥資源普查項目（財社[2018] 43號）

武繼斌(1995-)，男，河南洛陽人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2016級本科生(E-mail:978775897@qq.com);

郭玉潔(1997-)，女，河南焦作人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2016級本科生(E-mail:1049145346@qq .com);

李少彤(1997-)，女，河南滑縣人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2016級本科生(E-mail: 921168991@qq.com);

趙麗娟(1997-)，女，江西贛州人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2016級本科生(E-mail: 1661659279@qq.com);

*褚洪標(biāo)(1969-)，男，河南商丘人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學(xué)研究(E-mail: hongbiaochu@163.com);

梁兆昌(1963-)，男，江西吉安人，教授，主要從事生藥學(xué)研究(E-mail: liang6312@126.com).