培養(yǎng)液和體外保存方法對遼寧絨山羊胚胎活力的影響

豆興堂，王占紅，張曉鷹，朱延旭

（遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧遼陽 111000）

遼寧絨山羊是我國優(yōu)良的地方品種，因具有產(chǎn)絨量高、絨質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定、改良各地土種絨山羊產(chǎn)絨效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被國內(nèi)絨山羊產(chǎn)區(qū)引入以培育新品系或改良當(dāng)?shù)氐彤a(chǎn)羊。胚胎移植是優(yōu)良絨山羊擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段。在胚胎移植技術(shù)應(yīng)用過程中，胚胎體外培養(yǎng)保存技術(shù)對胚胎活力有較大影響。胚胎活力即胚胎的死活，鑒定方法主要為形態(tài)學(xué)鑒定、染色檢查、培養(yǎng)鑒定和移植檢驗(yàn)[1]。對胚胎體外培養(yǎng)效果影響較大的主要因素包括氨基酸、抗氧化劑、pH、溫度及氣相環(huán)境等，目前較為常用的胚胎體外培養(yǎng)液有TCM199、Ham's F-10 營養(yǎng)混合物（Ham's F-10 Nutrient Mixture）、合成輸卵管液（Synthetic Oviduct Fluid，SOF）、CR1、CZB 等[2]。一般在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液中適當(dāng)減除、替代或添加某些組分培養(yǎng)胚胎，通過評定培養(yǎng)后的胚胎活力和發(fā)育效果，以觀察分析處理因素對胚胎發(fā)育的影響和改進(jìn)培養(yǎng)液。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的必需氨基酸代謝和自由降解中會產(chǎn)生對胚胎有毒性的銨[3]，培養(yǎng)系統(tǒng)中添加β-巰基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME）可有效支持8-細(xì)胞期山羊胚胎克服發(fā)育阻滯而提高桑葚胚發(fā)育率[4]。目前，胚胎保存技術(shù)在超低溫（-196 ℃）[4]、低溫（4～6 ℃）[5]和常溫（22～25 ℃）[6]方面的研究已有報道，未見正常體溫（37～38.5℃）條件下相關(guān)研究報道。本實(shí)驗(yàn)嘗試通過優(yōu)化SOF 液，比較杜氏磷酸緩沖鹽溶液（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline,DPBS）、SOF、調(diào)整合成輸卵管液（Modify Synthetic Oviduct Fluid,m-SOF）對胚胎活力的影響，篩選最佳胚胎培養(yǎng)液；以篩選出的培養(yǎng)液作為胚胎保存液，比較胚胎體外保存方法對胚胎活力的影響，以期對絨山羊鮮胚保存、異地移植技術(shù)應(yīng)用有所借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

1.1.1 藥品 卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone,FSH）（加拿大，400 mg，批號：R9D19A）,促黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）(中國科學(xué)院)，陰道孕酮栓（EAZI-BREED CIDR）(新西蘭)，碘酊，酒精（75%，95%）等。

1.1.2 設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（Heracell 150），立體顯微鏡（Minitube），倒置顯微鏡（Leica，帶攝錄軟件），便攜式恒溫箱（Labotect），數(shù)控恒溫板（Leica），電子天平（精度0.000 1 g），自制手術(shù)車，移液器（1000 μL 可調(diào)，200 μL 可調(diào)，20 μL 可調(diào)）等。

1.1.3 器械 手術(shù)刀柄、刀片、手術(shù)剪、止血鉗、持針鉗、縫合針等手術(shù)器械。

1.1.4 耗材 沖胚管，集卵杯，沖胚針，敷料，縫合線，脫脂棉，巴氏玻管，0.22 μm 濾器，35 mm 培養(yǎng)皿，離心管(1.5 mL)，錫紙，封口膜等。

1.1.5 試劑 實(shí)驗(yàn)試劑包括DPBS（Gibco）、FBS（澳洲）、谷丙二肽（Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln）（A8185，≥98%）、β-ME（M3148，≥99.0%）、青鏈霉素液、BSA、HEPES、Na-Lactate、Na-Pryuvate、L-谷 氨 酰胺（L-Glutamine，L-Gln）、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、NaH2PO4、KH2PO4、NaHCO3、必需氨基酸（Essential Amino Acids，EAA）、非必需氨基酸（Non-Essential Amino Acids，NEAA）、Mineral Oil 等，以上試劑除注明外，均為Sigma 試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胚胎獲取 于2018 年4 月28 日—5 月17 日、9月12 日—9 月28 日選取3～6 歲遼寧絨山羊母羊，進(jìn)行超數(shù)排卵處理[7]。在母羊情期任意一天生殖道放置CIDR，并計為第0 天，第11 天下午開始肌肉注射FSH 1 mL，直到第15 天上午肌肉注射FSH 1 mL，期間每天上、下午各注射FSH 1 次，間隔12 h，第13 天下午同時肌肉注射PG 1 mL，第14 d 上午同時撤栓，第15 天公羊試情，若母羊發(fā)情，公羊本交配種同時肌肉注射LH 100 IU。配種后第6 天，手術(shù)法子宮角沖取桑椹期-早囊期胚胎。獲取的胚胎洗滌1～3 次，經(jīng)胚胎形態(tài)學(xué)鑒定[8]發(fā)育階段與質(zhì)量，備用。

1.2.2 胚胎活力評定 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用染色法和體外培養(yǎng)法評定胚胎活力。培養(yǎng)和保存前胚胎應(yīng)用形態(tài)鑒別法鑒定胚胎發(fā)育階段，0.5% 臺盼藍(lán)溶液[1]染色鑒定胚胎活力，鑒定為活胚胎的進(jìn)行培養(yǎng)和保存實(shí)驗(yàn)；培養(yǎng)后的胚胎再經(jīng)形態(tài)鑒別法和染色法評定胚胎活力，即經(jīng)體外培養(yǎng)后胚胎向下一階段發(fā)育即為活胚胎，形態(tài)變化不大的經(jīng)染色法評定活力。胚胎體外培養(yǎng)保存液是以PBS[7]液和SOF[9]液為基礎(chǔ)液，添加EAA、NEAA、BSA、FBS 等分別配制成胚胎保存液。

1.2.3 胚胎體外培養(yǎng)保存方法 從供體母羊沖取的胚胎，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)育階段和質(zhì)量合格后，用2 種方法進(jìn)行保存，24 h 后經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定胚胎發(fā)育階段與質(zhì)量。方法Ⅰ：同一只母羊的相同發(fā)育階段的胚胎，置入200 μL保存液液滴中（在35 mm 培養(yǎng)皿中做4 個200 μL 液滴），2 枚/液滴，上覆礦物油，做好胚胎發(fā)育階段、數(shù)量標(biāo)記。35 mm 培養(yǎng)皿用封口膜密封皿蓋與皿體間隙，外包裹錫紙，置于38.5℃恒溫板。方法Ⅱ：同一只母羊的相同發(fā)育階段的胚胎，置入500 μL 保存液上覆礦物油的1.5 mL 離心管中，2 枚/管，做好胚胎發(fā)育階段、數(shù)量標(biāo)記。離心管口與蓋用封口膜密封，外包裹錫紙，置于37℃便攜式恒溫箱中。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 實(shí)驗(yàn)從優(yōu)化調(diào)整SOF[9]胚胎保存液、SOF 液與DPBS 液對胚胎活力的影響和胚胎保存方法對胚胎活力的影響方面進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)Ⅰ：以1 mmol/mL Ala-Gln[10-11]替換1 mmol/mL L-Gln、添加0.5 g/Lβ-ME的SOF 液為實(shí)驗(yàn)組，于38.5 ℃、5% CO2、5% O2、95% N2飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，對比實(shí)驗(yàn)組與對照組（SOF 液）對胚胎活力的影響；實(shí)驗(yàn)Ⅱ：以1 mmol/mL Ala-Gln 替換1 mmol/mL L-Gln、10 mmol/L HEPES[11]和4 mmol/L NaHCO3替 換25 mmol/L NaHCO3、添加0.5 g/Lβ-ME 的m-SOF 液為實(shí)驗(yàn)組，于38.5℃、5%CO2、5% O2、95% N2飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，比較與SOF 液組、DPBS 液組對胚胎活力的影響；實(shí)驗(yàn)Ⅲ：以實(shí)驗(yàn)Ⅱ篩選的培養(yǎng)液為保存液，采用保存方法Ⅰ和方法Ⅱ保存胚胎，于24、36 h 評價胚胎發(fā)育情況，比較胚胎體外保存方法對胚胎活力的影響。

1.3 統(tǒng)計分析 利用SPSS 15.0 軟件Independent-Samples T Test 和One-Way ANOVA 模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)。P>0.05 表示差異不顯著，P<0.05 表示差異顯著；P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Ala-Gln、β-ME 對絨山羊胚胎活力的影響 由表1 可知，添加1 mmol/mL Ala-Gln、5 g/Lβ-ME 的 SOF 胚胎培養(yǎng)液組胚胎發(fā)育率高于對照組（P>0.05）。表明添加Ala-Gln 和β-ME 能夠維持絨山羊胚胎體外正常發(fā)育環(huán)境，促進(jìn)胚胎體外發(fā)育。

表1 添加Ala-Gln、β-ME 對絨山羊胚胎活力的影響

2.2 m-SOF、SOF 和DPBS 液對絨山羊胚胎活力的影響由表2 可知，m-SOF 組的胚胎發(fā)育率顯著高于SOF 組，極顯著高于DPBS 組；SOF 組的胚胎發(fā)育率極顯著高于DPBS 組。這表明添加Ala-Gln、β-ME、HEPES 和調(diào)整NaHCO3含量的m-SOF 液更適合于胚胎體外發(fā)育，HEPES 對胚胎體外發(fā)育沒有不良影響。

2.3 體外保存方法對絨山羊胚胎活力的影響 由表3 可知，胚胎保存方法Ⅱ于體外保存24 h 時胚胎發(fā)育率低于保存方法Ⅰ（P>0.05），但36 h 時胚胎發(fā)育率高于保存方法Ⅰ（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著胚胎體外保存時間延長，保存方法Ⅱ更適于胚胎體外發(fā)育。圖3-A為胚胎體外保存方法Ⅱ保存后部分發(fā)育的胚胎，圖3-B為使用便攜式恒溫箱的胚胎體外保存方法Ⅱ，圖3-C 為胚胎體外保存方法Ⅱ保存后部分脫帶囊胚，可見脫帶囊胚和游離的透明帶。

表2 m-SOF、SOF 和PBS 液對絨山羊胚胎活力的影響

表3 體外保存方法對絨山羊胚胎活力的影響

3 討 論

羊胚胎體外培養(yǎng)一般用添加氨基酸、血清等成分的SOF 液，體外保存時胚胎易受到保存液pH、氧化、代謝產(chǎn)物副作用及溫度波動等因素影響而導(dǎo)致發(fā)育失敗。本實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，添加1 mmol/mL Ala-Gln、5 g/Lβ-ME 的 SOF 液提高了體外培養(yǎng)24 h 的胚胎活力，可能與Ala-Gln 和β-ME 的特性與作用有關(guān)。Ala-Gln 是丙氨酸與谷氨酰胺形成的二肽，對熱消毒具有穩(wěn)定性，形成的氨損害效果比Gln 小，可能對胚胎有保護(hù)作用，促進(jìn)胚胎增殖發(fā)育。趙敬湘等[12]研究表明，Ala-Gln 對細(xì)胞缺氧缺糖損傷有明顯的保護(hù)作用；劉志青[13]研究發(fā)現(xiàn)，Ala-Gln、Gln 和Ala 補(bǔ)充都能促進(jìn)受損C2C12成肌細(xì)胞的分化能力，而只有補(bǔ)充Ala-Gln 可提高受損細(xì)胞的增殖能力。β-ME 可以減少二硫鍵，并且能通過清除羥基自由基等，具有抗氧化作用。舒建洪等[14]研究發(fā)現(xiàn)β-ME 對牛卵母細(xì)胞核成熟無促進(jìn)作用，但可提高牛孤雌胚胎的卵裂率并促使囊胚發(fā)育。相關(guān)研究結(jié)果印證了Ala-Gln、β-ME 對胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用。

進(jìn)一步優(yōu)化的m-SOF 液胚胎體外培養(yǎng)24 h 的胚胎活力極顯著高于DPBS 液，顯著高于SOF 液，表明HCO3-1與HEPES-1酸堿緩沖適于胚胎發(fā)育所需酸堿環(huán)境。m-SOF 液相比SOF 降低了HCO3-1濃度，增加了HEPES、Ala-Gln、β-ME 等成分，HCO3-1與HEPES-1協(xié)同增強(qiáng)了酸堿緩沖能力，pH 保持在7.1～7.5，為胚胎發(fā)育提供了穩(wěn)定的酸堿環(huán)境[10]。DPBS 液成分簡單，優(yōu)點(diǎn)是在低溫中能夠較長時間保持pH 穩(wěn)定[8]。本試驗(yàn)中DPBS 液體外培養(yǎng)24 h 胚胎活力為43.93%。

圖3 胚胎體外保存方法和保存后胚胎

羊胚胎移植技術(shù)實(shí)際應(yīng)用中，若開展胚胎異地運(yùn)輸、移植等種羊擴(kuò)繁工作，胚胎體外保存技術(shù)將成為胚胎移植效率的重要影響因素，一般有超低溫、低溫、常溫等保存形式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保存方法Ⅱ保存胚胎36 h 時胚胎活力為42.76%，極顯著高于保存方法Ⅰ，可能與方法Ⅱ溫度為37℃低于方法Ⅰ38.5℃有關(guān)，胚胎在體外38.5℃環(huán)境下可能發(fā)育較快，2 次觀察時已發(fā)育到擴(kuò)張囊胚期的胚胎形態(tài)變化不大，但37℃下胚胎體外保存時間更長些、活力高。保存24 h 時保存方法Ⅰ的胚胎活力高于保存方法Ⅱ，可能與溫度有關(guān)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在38.5 ℃、5% CO2、5% O2、95% N2飽和濕度條件下，用m-SOF 液培養(yǎng)絨山羊胚胎可以獲得較高的發(fā)育率；以m-SOF 液、保存方法Ⅱ（胚胎置入上覆礦物油的500 μL 保存液的1.5 mL 離心管中，2 枚/管，離心管口與蓋用封口膜密封，外包裹錫紙，置于37℃便攜式恒溫箱中保存）保存胚胎36 h 時發(fā)育率為42.76%。還需要進(jìn)一步開展保存胚胎的移植實(shí)驗(yàn)，依據(jù)胚胎移植妊娠率來驗(yàn)證胚胎體外保存方法的有效性。