不同飼養(yǎng)模式下成年灘羊瘤胃真菌多樣性及菌群結構的變化

付子琳，陳 林，李 娜，徐曉鋒，張力莉

（寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750021）

灘羊是我國西北地區(qū)獨特的綿羊品種，以寧夏中、北部為中心產(chǎn)區(qū)，年存欄規(guī)模約300 萬只。瘤胃是反芻動物最主要的消化器官，其菌群結構影響瘤胃的發(fā)酵功能[1]。Owens 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物對攝入飼料進行代謝作用，其代謝產(chǎn)物和微生物蛋白將作為反芻動物的能量和蛋白質的最主要來源。與此同時，原蟲吞噬行為、自溶現(xiàn)象以及高的脫氨基活性會造成氮的無效利用。因此，改善瘤胃菌群結構對促進反芻動物生長健康、提高其纖維降解和飼料轉化效率具有重要意義。瘤胃微生物主要包括纖毛蟲、真菌及細菌，其中，真菌占總量的5%～20%。瘤胃真菌含有消化植物組織所需要的酶，包括纖維素酶、木聚糖酶以及其他水解酶等，主要附著于纖維類植物飼料表面，參與復雜碳水化合物的初步降解。雖然真菌占瘤胃微生物的比例不多，但真菌個體較大，且其復雜性以及酶活性在消化纖維中起主要作用[3-5]。

目前能夠檢測并定義的瘤胃厭氧真菌主要包括新美鞭菌屬、盲腸鞭菌、梨囊鞭菌屬、Anaeromyces屬、Orpinomyces屬及Cyllamyces屬6 個屬[6]。不同種屬微生物在瘤胃內占據(jù)不同生態(tài)位，其組成與種群密度隨飼喂而改變[7]。近年來，灘羊的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式由放牧轉為舍飼，由采食荒漠及干旱草原牧草為主轉向以人工牧草和作物秸桿以及補充精料為主。為此本研究基于ITS 測序分析技術首次檢測飼養(yǎng)方式對灘羊瘤胃真菌菌群結構與多樣性的影響，為灘羊的營養(yǎng)調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選擇體重（30.12±3.23）kg、體況健康的9 月齡去勢灘羊24 只，隨機分為放牧組和舍飼組，放牧組灘羊于2017 年9 月份在鹽池寧鑫生態(tài)牧場全天放牧，為期3 個月，可自由采食草場牧草（沙打旺、胡枝子、苦豆子、檸條、甘草等），每天放牧13 h（07:00—20:00），無補飼；舍飼組飼喂混合日糧，原料成分及營養(yǎng)成分見表1，每天早晚飼喂2 次，自由采食。

1.2 樣品采集與處理 在試驗灘羊12 月齡時，2 組隨機各取5 只灘羊進行屠宰，采集瘤胃內容物于50 mL 離心管中，放置于-80℃冰箱（DW-HL528S，中科美菱）中凍存，用于瘤胃真菌菌群分析。共10 個樣品，其中放牧組5 個（G12-1、G12-2、G12-3、G12-4、G12-5），舍飼組5個（R12-1、R12-2、R12-3、R12-4、R12-5）。

表1 舍飼組灘羊日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質基礎）

1.3 樣品DNA 提取與測序 運用試劑盒法提取樣本總DNA，試劑盒由南京建成生物研究所提供。樣本總DNA 提取后，利用PCR 儀（ETC811，EASTWIN），用帶有barcode 的特異引物擴增ITS rDNA 的ITS2 區(qū)域。引物序列為KYO2F：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反應體系為50 μL：DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，25 mmol/L MgSO43 μL，10×Buffer KOD 5 μL，KOD 酶1 μL，ddH2O（無酶水）32 μL。PCR 反應條件：94℃預變性2 min，98℃變性10 s，退火30 s，退火溫度為62℃，68℃延伸30 min，共32個循環(huán)；最后68℃延伸5 min。使用AMPure XP Beads對擴增產(chǎn)物進行純化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies）對其純化產(chǎn)物進行定量，引物序列同上，根據(jù)illumina Hiseq2500 的PE250 模式pooling 上機測序。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進行初步處理，采用 SAS 8.2 統(tǒng)計軟件中的完全隨機設計方差分析進行組間差異顯著性比較；菌群豐度采用Metastats 軟件進行分析。結果表示為平均值±標準誤，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果

2.1 樣品測序深度分析 如圖1 所示，當測序深度超過5 000 reads 時，曲線趨于平緩，各樣品達到飽和狀態(tài)，表明本試驗的測序深度足以覆蓋各樣品中大多數(shù)微生物，測序深度增加已經(jīng)不影響物種多樣性，樣品Shannon 曲線高度沒有明顯組間差異。

圖1 Shannon 曲線

2.2 瘤胃真菌OTUs 比較 經(jīng)Illumina Hiseq 測序結束后，除去低質序列，通過序列拼接，應用Mothur，根據(jù)97% 的序列相似度，對序列進行OTU 劃分。根據(jù)OTU 聚類分析結果，分析不同樣品的聚類信息，依照其共有、特有的OTU 信息繪制韋恩圖（Venn graph）。如圖2 所示，放牧組（G12）灘羊瘤胃真菌OTU 總數(shù)有347 個，舍飼組（R12）OTU 總數(shù)有322 個，2 組共有的OTU 數(shù)量為169。

2.3 PCoA 分析 基于樣本間的加權（Weighted Unifrac）和非加權（Unweighted Unifrac）數(shù)據(jù)結果，繪制出PCoA（Principal Coordinates Analysis）圖形，直觀顯示不同環(huán)境樣品中微生物進化上的相似性及差異性。分析結果中，樣品越相似，反映在PCoA 圖中的距離越近，而且不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出各自聚集的分布情況。

圖2 試驗灘羊瘤胃真菌菌群韋恩圖

如圖3-a 所示，未加權僅考慮物種有無變化時，放牧組（G12）5 個樣本相對集中，舍飼組（R12）1、3、5 號樣本相對集中，而2 號、4 號在第二主成分縱向上樣本距離較大，與組內其他樣本相似性較小；而加權后（圖3-b）同時考慮了物種有無和豐度的變化，放牧組中1 號與其他4 個樣本差異較大，舍飼組內樣本差異性較大。

圖3 PCoA 分析

2.4 瘤胃真菌Alpha 多樣性分析 由表2 可知，放牧組的Chao1 和ACE 值均顯著高于舍飼組，說明放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度高于舍飼組；而Shannon 和Simpson指數(shù)組間差異不顯著，表明當綜合物種豐富度和均勻度比較時，不同飼養(yǎng)方式對成年灘羊瘤胃真菌多樣性影響不顯著。

表2 樣品在0.03 距離下的Alpha 豐富程度

2.5 瘤胃真菌菌群結構

2.5.1 門水平 由表3 可知，放牧組中鑒定出6 個門，舍飼組中鑒定出4 個門，含量在5% 以上的優(yōu)勢菌門均為新麗鞭毛菌門（Neocallimastigomycota）和子囊菌門（Ascomycota），含量超過90%；含量在0.5%～5%的次優(yōu)菌門均為擔子菌門（Basidiomycota） 和1 種未注釋菌門；此外，僅在放牧組中檢測出微量的毛霉門（Mucoromycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）。灘羊瘤胃真菌不同菌門在不同飼養(yǎng)方式下均無顯著差異，但放牧組鑒定出的灘羊瘤胃菌門多于舍飼組。

表3 灘羊瘤胃真菌結構門水平的變化

2.5.2 屬水平 放牧組共鑒定出65 個屬，舍飼組共鑒定出58 個屬，放牧組多于舍飼組。2 組屬水平上的優(yōu)勢菌（豐度在5% 以上）、次優(yōu)菌屬（豐度均在0.5%～5%）及差異菌屬見表4。本試驗中，差異菌屬共有6 種，其中優(yōu)勢菌屬均無顯著性差異，次優(yōu)菌屬有4種。放牧組共鑒定出3 個優(yōu)勢菌屬，分別為梨囊鞭菌屬（Piromyces）、Kazachstania屬及1 個未注釋菌屬；9個次優(yōu)菌屬分別為赤霉菌屬（Gibberella）、附球菌屬（Epicoccum）、Naganishia屬、線黑粉菌屬（Filobasidium）、酵母屬（Saccharomyces）、鏈格孢屬（Alternaria）、Meyerozyma屬、Papiliotrema屬、未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）、新美鞭菌屬（Neocallimastix）及Pleonectria屬；其中放牧組Naganishia屬、線黑粉菌屬（Filobasidium）和酵母屬（Saccharomyces）3 個菌屬含量極顯著高于舍飼組。舍飼組共鑒定出4 個優(yōu)勢菌群，分別為梨囊鞭菌屬（Piromyces）、Kazachstania、1 個未注釋菌屬及附球菌屬（Epicoccum）；8 個次優(yōu)菌屬分別為鏈格孢屬（Alternaria）、Meyerozyma屬、未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）、新美鞭菌屬（Neocallimastix）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、節(jié)擔菌屬（Wallemia）、雙足囊菌屬（Dipodascus）及Paraphaeosphaeria屬；其中，節(jié)擔菌屬（Wallemia）含量極顯著高于放牧組；Paraphaeosphaeria屬含量較放牧組有升高趨勢（P>0.05）。此外，放牧組中Pleonectria屬含量顯著高于舍飼組；而平臍蠕孢屬（Bipolaris）和裂褶菌屬（Schizophyllum）含量有升高趨勢（P>0.05）；香蘑屬（Lepista）含量顯著降低；而盲腸鞭菌屬（Caeco myces）含量有降低趨勢（P>0.05)。

表4 灘羊瘤胃真菌結構屬水平的變化

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)方式對灘羊瘤胃真菌菌群豐富度影響 厭氧真菌在瘤胃微生物占比較低且生長速度慢，與細菌相比，在瘤胃系統(tǒng)中處于劣勢。但真菌能夠與細菌競爭生長環(huán)境并存活，應當具備其特有的功能[8]。瘤胃真菌假根可深入刺穿到植物細胞壁角質層內，利用酶對植物細胞壁進行分解。雖然目前研究表明植物纖維主要由瘤胃細菌降解，但是真菌能夠首先植入纖維組織內部進行反應[9-10]。本試驗中，結合OTU 比較以及Alpha 多樣性Chao1和ACE 指數(shù)的分析可以看出，放牧組瘤胃真菌豐富度顯著高于舍飼組。Grenet 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與淀粉含量較高的飼料相比，木質素含量較高的飼料更有利于厭氧真菌生長，而且真菌會選擇性地附著于纖維成分。孫云章等[12]采用體外厭氧共培技術發(fā)現(xiàn)，適當?shù)木直扔欣诹鑫刚婢屠w維降解細菌在發(fā)酵前期建立起相對穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系；但隨著精料比例的增大，真菌數(shù)量逐漸降低直到消失，細菌數(shù)量逐漸上升，同時系統(tǒng)的產(chǎn)氣量顯著增加。Belanche 等[13]研究表明，與高淀粉日糧相比，瘤胃細菌真菌的豐富度在奶牛采食高中性洗滌纖維日糧時豐富度更高，且纖維降解菌的濃度顯著增加。本試驗中，采食相對較高含量纖維的放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著增加，與前人結果相一致。

3.2 飼養(yǎng)方式對瘤胃真菌菌群結構的影響 反芻動物所攝入的營養(yǎng)物質大部分是進入瘤胃后通過瘤胃微生物發(fā)酵進而吸收的[14]，因此日糧的營養(yǎng)結構影響瘤胃的發(fā)酵功能，對瘤胃菌群結構有所影響。多數(shù)瘤胃厭氧真菌屬都能分解纖維素，可產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等，用于降解植物細胞壁[15]。而瘤胃不同屬厭氧真菌降解植物的能力有所不同，新美鞭菌屬（Neocallimastix）和梨囊鞭菌屬（Piromyces）降解秸稈的能力較強，而盲腸鞭菌屬（Caecomyces）相對較弱[16]。本試驗中，梨囊鞭菌屬（Piromyces）在2 組中均是第一優(yōu)勢菌屬，雖然含量均值相差約14%，但并沒有顯著的組間差異；而盲腸鞭菌屬（Caecomyces）屬含量在舍飼組中有升高趨勢；其他纖維降解真菌，如未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）和新美鞭菌屬（Neocallimastix）組間差異也不顯著。Kazachstania及1 個未注釋菌屬作為2 個優(yōu)勢菌屬，其功能屬性還有待更深的研究。

Naganishia、線黑粉菌屬（Filobasidium）和酵母屬（Saccharomyces）3 個菌屬在放牧組中為次優(yōu)菌屬，且含量顯著高于舍飼組。這3 個菌屬均屬于酵母菌[17-18]。飼糧中添加酵母菌制劑可以改善反芻動物能過改善瘤胃內環(huán)境，且酵母屬（Saccharomyces）具有降解赭曲霉毒素的能力，有一些酵母菌還可以降解嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素[19-20]。

舍飼組節(jié)擔菌屬（Wallemia）和香蘑屬（Lepista）含量顯著升高。有研究表明，香蘑屬（Lepista）能夠較好地利用二糖，可以在偏酸性（pH=4.5）環(huán)境中生存[21]且存在腐生菌種[22]；節(jié)擔菌屬（Wallemia）通常生長在食物與室內環(huán)境中，在腐生植物上也可以提取到[23]，節(jié)擔菌屬（Wallemia）在高溫發(fā)酵和腐熟階段均為優(yōu)勢菌群[24]。Paraphaeosphaeria屬在舍飼組內有升高趨勢，但其在瘤胃中的功能作用報道較少，有待更進一步研究。

4 結 論

綜上所述，不同飼養(yǎng)方式對12 月齡灘羊瘤胃真菌菌群多樣性并未產(chǎn)生顯著影響，但放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著高于舍飼組；不同飼養(yǎng)方式對瘤胃真菌菌群結構存在存在一定影響，其中差異菌屬有6 種，其中包含4 種次優(yōu)菌屬。