大豆卵磷脂與卵黃在山羊精液冷凍過程中的聯(lián)合作用研究

范文華，戴建軍，張樹山，孫玲偉，吳彩鳳，張德福*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

家畜精液冷凍通常以卵黃（EY）作為冷凍保護劑，但EY 成分復雜且安全性頗受質(zhì)疑[1]。大豆卵磷脂（SL）富含低密度脂蛋白（LDL），可在精子冷凍過程中作為無動物源性冷凍保護劑保護精子膜免受低溫損傷，并已得到部分應(yīng)用[2-3]。如蔡虹[4]在牛精液冷凍中添加3%SL，解凍后活力和畸形率與EY 對照組均無顯著性差異；胡傳水等[5]以1.5%SL 完全取代20%EY 稀釋液，解凍后精子質(zhì)量與對照組無顯著性差異；Forouzanfar 等[6]研究發(fā)現(xiàn)使用1%SL 可替代20%EY 冷凍保存綿羊精液。Sun 等研究發(fā)現(xiàn)[7]，山羊冷凍過程中SL 的最佳添加濃度為2%，目前未見SL 和EY 在精液冷凍過程中聯(lián)合應(yīng)用的報道。本實驗將EY 和SL 按一定比例混合配制稀釋液，解凍后觀察精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性，并通過檢測抗氧化指標確定EY 和SL 在山羊精液冷凍過程中是否有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 除特別說明外，所有試劑均購自Sigma 公司，超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購于碧云天公司。采精用的8 頭崇明白山羊種公羊來源于上海市農(nóng)業(yè)科學院食草動物綜合試驗站，

1.2 稀釋液的配制 基礎(chǔ)稀釋液的配制：稱取檸檬酸1.825 2 g、葡萄糖0.504 4 g 和 TRIS 3.634 2 g，溶解后加入200 IU/mL 雙抗（河北遠征藥業(yè)有限公司）、6 mL甘油，混勻，定容至100 mL。

試驗共分5 組，分別在基礎(chǔ)稀釋液中添加20%EY、2%SL、10%EY+2%SL、20%EY+1%SL、20%EY+2%SL。

1.3 精液采集 山羊精液采用假陰道法采集，經(jīng)常規(guī)檢測，精子活率在80%以上的精液方可用于后續(xù)試驗。

1.4 精液冷凍 將8 頭種公羊精液混合，平均分成5 份，按精液∶冷凍稀釋液體積比1:3 加入稀釋液混勻，移至4℃環(huán)境低溫平衡2 h。平衡后樣品在4℃環(huán)境下快速分裝為0.25 mL 細管精液，移入液氮面上3 cm，熏蒸15 min 后迅速投入液氮中超低溫冷凍保存。

1.5 精液解凍 將液氮中保存的細管取出，投入70℃水浴鍋內(nèi)解凍5 s，按精液:稀釋液體積比1:10 稀釋后混勻，于37℃水浴鍋中孵育10 min。

1.6 精子質(zhì)量檢測

1.6.1 精子活率與活力 使用計算機輔助精液分析儀（邁朗，SJ-TMDI608）測定精子活率和精子活力，每個樣品隨機選取4 個視野（n ≥200）。

1.6.2 頂體完整率 吉姆薩染色法測定精子頂體完整率[8]。解凍后精液使用預(yù)熱的無甘油基礎(chǔ)稀釋液50 倍稀釋后涂片，風干。甲醇固定15 min 沖洗干凈。使用吉姆薩染色12 h，沖洗干凈，風干后鏡檢，精子頂體結(jié)構(gòu)明顯染色，頂體完整、外形正?；蝽旙w輕微膨脹為頂體完整精子，頂體嚴重膨脹或頂體脫落為頂體畸形精子[9]。1000×顯微鏡下隨機選取4 個視野（n ≥200）觀察統(tǒng)計頂體完整率。

1.6.3 質(zhì)膜完整率 低滲腫脹試驗（HOST）測定精子質(zhì)膜完整性[10]。將10 μL 精液與100 μL 100 mOsm 低滲溶液（0.9 g 果糖和0.49 g 檸檬酸鈉溶于100 mL 蒸餾水）混勻，37℃孵育30 min，相差顯微鏡（×400）下隨機觀察4 個視野（n ≥200），精子尾部卷曲為質(zhì)膜完整，無卷曲表明精子質(zhì)膜不完整，計算出質(zhì)膜完整精子的百分比。

1.6.4 線粒體活性檢測 待測樣品稀釋至1.5×106/mL，加入10 μL 的羅丹明123（1 μmoL/L）和10 μL 碘化丙啶（1 mg/mL）混合，37 ℃避光孵育30min 后，吸取10 μL 樣品制片。在400×倒置熒光顯微鏡，波長520 nm下隨機選取4 個視野（n ≥200）觀察，精子呈現(xiàn)紅色熒光為死精，精子尾部呈現(xiàn)綠色熒光有線粒體活性[11]。統(tǒng)計各組百分率。

1.6.5 抗氧化指標檢測 精子冷凍-解凍后ROS、MDA和SOD 水平分別采用碧云天公司提供的試劑盒檢測。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），差異顯著時采用Duncan′s 方法對各組間平均數(shù)進行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標準誤，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精質(zhì)量的影響 由表1 可知，10%EY+2%SL 組解凍后精子質(zhì)量最高，其精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率顯著高于20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL 組，與20%EY 對照組和2%SL 組無顯著差異。

表1 不同冷凍稀釋保護劑對崇明白山羊凍精質(zhì)量的影響 %

2.2 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精線粒體活性的影響 圖1 在3 組聯(lián)合添加組中，10%EY+2%SL 組解凍后精子的線粒體活性顯著高于另外2 組，但與20%EY對照組和2%SL 組無顯著差異，20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL組的線粒體活性顯著低于20%EY和2%SL組。

圖1 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對精子線粒體活性的影響

2.3 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精抗氧化能力的影響如圖2 所示，10%EY+2%SL 組解凍后精子的SOD 值為150.77 U/mL，顯著高于20%EY+1%SL 組（102.19 U/mL）和20%EY+2%SL 組（101.17 U/mL），但與20%EY 對照組（151.74 U/mL）和2%SL 對照組（147.18 U/mL）無顯著性差異。10%EY+2%SL 組、20%EY 對照組和2%SL對照組的ROS 和 MDA 水平均顯著低于20%EY+1%SL和20%EY+2%SL 組。

3 討 論

圖2 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精抗氧化能力的影響

EY 作為家畜精液冷凍保護劑，易在精液冷凍和后續(xù)體外受精過程中帶來微生物污染，且山羊精漿中的卵黃凝固酶可將EY 中的卵磷脂水解為脂肪酸和溶血卵磷脂，而后者對山羊精子的活力和頂體產(chǎn)生損害作用[12]。本研究首次在冷凍稀釋液中添加SL 以替換或降低EY使用濃度，結(jié)果表明冷凍稀釋液中使用2% 的 SL 可完全替代EY，取得了與20%EY 組相近的冷凍解凍效果。SL 主要包括磷酯類和非磷脂類物質(zhì)，磷酯類物質(zhì)大部分為LDL。研究證實，降溫會造成精子質(zhì)膜上的磷脂發(fā)生從液晶態(tài)到凝膠態(tài)的相位轉(zhuǎn)變，降低精子膜的流動性，導致膜剛性增強，易受冰晶物理傷害，SL 中的LDL 能為受損的精子膜提供外源性磷脂，從而降低精子膜相位轉(zhuǎn)變溫度，以便于冷凍過程中精子脫水，提高精子質(zhì)膜和頂體對冷凍傷害的耐受性，同時也可作為外源性磷脂來替代修補超低溫損傷的精子膜磷脂，從而維持質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，防止精子冷休克[13-15]。另一方面，LDL 可在細胞周圍形成保護層，以防止快速降溫細胞冰晶的形成，保護精子膜在冷凍-解凍過程中免受機械損傷[16]。本研究也證實了SL 在山羊精液冷凍中具有與EY 相似的冷凍保護效果。

精液冷凍過程中，10%EY+2%SL 組獲得了最高冷凍效率，可能與SL 的添加降低EY 使用濃度，減少卵黃凝固酶（EYCE）對精子的毒害作用有關(guān)。EYCE 可誘導稀釋液中卵黃凝結(jié)，催化卵黃脂類物質(zhì)中脂肪酸的釋放，造成精液pH 下降，從而導致孵育后精子死亡。結(jié)果表明，與單獨添加EY 或SL 相比較，10%EY+2%SL組解凍后精子質(zhì)膜和頂體完整性提高的主要原因可能是EY 和SL 的聯(lián)合添加可能會彌補卵磷脂單一來源的局限性，改善冷凍效果。然而，這兩種冷凍保護劑之間的相互作用尚不清楚。有研究表明，稀釋液中的EY 會加速精子發(fā)生獲能反應(yīng)，降低精子存活時間，因此在冷凍過程中，降低稀釋液中的EY 濃度，同時利用SL 補充添加冷凍所需的必須成分，可更好地保護精子的頂體[17]。本實驗中10%EY+2%SL 聯(lián)合添加組亦獲得了最佳的精子活力、精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性。

本實驗未發(fā)現(xiàn)EY 和SL 存在協(xié)同作用，20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL 組山羊精子解凍后的精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性均顯著低于10%EY+1%SL 組，可能是因為高濃度EY 稀釋液再聯(lián)合添加其他來源的卵磷脂將導致稀釋液中卵磷脂濃度增加，加大稀釋液黏稠度，使精子游動阻力增大，消耗更多ATP。大量ATP 消耗將會使精子提前獲能，獲能是精子凋亡的誘因之一，同時部分精子提前發(fā)生頂體反應(yīng)，進而喪失受精能力。精子運動所需要的 ATP 大部分來自線粒體，因此精子的運動能力與線粒體活性密切相關(guān)。Del 等[18]在綿羊精液冷凍中使用3.5%SL 作為冷凍保護劑，解凍后精子線粒體活性顯著降低。SL 超過一定濃度會誘導線粒體跨膜電位降低，引起線粒體膜內(nèi)外發(fā)生生化改變，導致ATP 合成酶等與驅(qū)動 ATP 合成有關(guān)的大分子物質(zhì)丟失，從而降低ATP 合成，對精子運動產(chǎn)生不可逆影響。

線粒體活性直接影響精子運動能力，而線粒體損傷亦與精子的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。冷凍保存過程中溫度的變化會對精子產(chǎn)生物理性、化學性和氧化性損傷。氧化應(yīng)激可能會導致線粒體功能喪失、DNA 斷裂、染色體損傷，從而導致精子運動和受精能力降低、情期妊娠率與產(chǎn)仔率下降、羔羊畸形率增加等現(xiàn)象。精子細胞內(nèi)線粒體在精子代謝過程中產(chǎn)生大量ROS，活性氧自由基可引起精子膜上脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，造成細胞損傷凋亡的同時還能對精子基因組造成傷害[19]。精子內(nèi)的SOD 在凍精中可有效清除ROS 氧化損傷產(chǎn)生的多種活性氧物質(zhì)，這些活性氧物質(zhì)對富含多不飽和脂肪酸的精子細胞產(chǎn)生潛在危害。本實驗結(jié)果表明，山羊精液冷凍稀釋液中聯(lián)合添加10%EY+2%SL 時的精子SOD 含量顯著高于20%EY+1%SL 組和10%EY+2%SL 組，ROS水平顯著降低，與2%SL 組和20%EY 組無顯著性差異，表明聯(lián)合添加10%EY+2%SL 在降低氧化損傷效果上與單獨添加EY 和SL 冷凍保護劑保持一致，并與精子的運動、質(zhì)膜與頂體完整性數(shù)據(jù)相呼應(yīng)。10%EY 聯(lián)合添加SL 可部分提高精子抗氧化損傷能力、降低氧化損傷，減少精子細胞膜損傷，提高精子活力。20%EY 聯(lián)合添加SL 則表現(xiàn)為對精子的促氧化損傷，嚴重影響凍精質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在山羊精液冷凍保存中，添加2%SL 對解凍后精液質(zhì)量沒有任何不利影響，可以作為精液冷凍保護劑有效代替EY；聯(lián)合添加EY 和SL 并無明確的協(xié)同作用，20%EY 聯(lián)合添加SL 甚至會對凍融后精子產(chǎn)生毒害作用。