蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的DNA 甲基化與表達量分析

楊雪梅 ，徐新明，付雪峰，杜建文，王 丹，田月珍，田可川*，黃錫霞*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院畜牧研究所新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖重點實驗室，新疆烏魯木齊 830011）

毛發(fā)是毛囊生長發(fā)育的產(chǎn)物，是重要的動物產(chǎn)品和紡織原材料。毛囊是皮膚的衍生物，其結(jié)構(gòu)和特性決定了毛發(fā)的品質(zhì)及產(chǎn)量[1]。毛囊的生長發(fā)育是一個復(fù)雜且長期的生理過程，受多種物理因素[2]、多種分子及信號通路[3]調(diào)控，而基因表達是影響動物毛發(fā)生長發(fā)育的決定性因素之一[4]。因此，了解毛囊發(fā)育相關(guān)基因的功能有助于深入了解毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機制。有研究表明，WNT 信號通路參與了毛囊生長發(fā)育過程中的多個重要環(huán)節(jié)，且對毛囊干細胞的調(diào)控至關(guān)重要[5]。WNT2基因是目前研究最廣泛且能激活經(jīng)典通路的WNT 信號之一[6]，并參與了細胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)，與癌癥有密切關(guān)系[7]。WNT 信號通路中的WNT2在毛囊形態(tài)發(fā)生中起到重要作用[8]。因此，推測WNT2基因可能是綿羊羊毛性狀的潛在候選基因。

表觀遺傳學修飾是指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，通過某些機制決定基因表達，并引起細胞表型的變化，從而影響到生命活動。影響基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學調(diào)控包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等[9]。DNA 甲基化是基因表達調(diào)控中的重要問題，也是遺傳學和繁殖領(lǐng)域的重要問題。DNA 甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)也是目前研究最深入的表觀遺傳修飾之一。有研究表明，在家畜生長發(fā)育過程中，DNA 甲基化參與許多代謝過程[10]，并且DNA 甲基化在家畜中已被廣泛研究。

本研究以蘇博美利奴羊為研究對象，分別從表觀遺傳和分子遺傳2 個方面來分析皮膚組織中WNT2基因的DNA 甲基化程度與表達量之間的關(guān)系，旨在探討DNA 甲基化對羊毛性狀發(fā)育調(diào)控的影響，以期填補細毛羊DNA 甲基化研究領(lǐng)域的空白，為細毛羊重要經(jīng)濟性狀的相關(guān)標記輔助選擇工作提供有效的表觀遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為新疆鞏乃斯種羊場所提供的健康無病、體況均勻的周歲蘇博美利奴母羊，分別選取5 只平均纖維直徑為16.90 μm（極細組）和5 只平均纖維直徑為19.53 μm（極粗組）的周歲蘇博美利奴母羊，采集其左側(cè)肩胛部皮膚2 cm×2 cm 組織樣品并用液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器 TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）、TIANquick Midi Purification Kit（DP204-02）購自天根生化科技有限公司（北京）；EZ DNA Methylation-GOLD Kit（D5005）、ZymoTaqTMPreMix（E2003）購自ZYMO Research 公司；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox、5X All-In-One MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）購自ABM（加拿大）；pMD19-T Vector Cloning Kit（6013）、E.coli JM109 Competent Cells（9052）購自TaKaRa 公司（大連）；TRIzol RNA分離試劑、Amp、胰蛋白胨、酵母提取物、DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、6×Loading Buffer 等。

主要使用儀器有ZHJH C1112B 型超凈工作臺、Light Cycler2.0 熒光定量PCR 儀、NANODROP 2000型分光光度計、BIOFUGE PRIMOR 型低溫離心機、DNP-9082A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器、凝膠成像儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA 提取及亞硫酸氫鹽修飾 根據(jù)TIA Namp Genomic DNA Kit（DP304）說明書對10 只蘇博美利奴羊個體的皮膚組織進行基因組DNA 提取，并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測合格的基因組DNA 按EZ DNA Methylation-GOLD Kit（D5005） 說明書進行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3.2 CpG 島預(yù)測及引物設(shè)計 利用在線軟件MethPrimer預(yù)測從NCBI 獲得的綿羊WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp 序列的CpG 島并設(shè)計BSP 引物（WNT2-bsp），并根據(jù)NCBI 上公布的綿羊WNT2基因（登錄號：NM_001195319.1）與基因（登錄號：NM_001190390.1）的序列，利用Primer Premier 5.0 軟件進行定量引物設(shè)計，最后由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

1.3.3 PCR 擴增及產(chǎn)物純化 對目的基因WNT2進行PCR擴增，總反應(yīng)體系25 μL：ZymoTaqTMPreMix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板 2 μL，用RNase-free ddH2O 補至25 μL。擴增程序為95℃預(yù)變性10 min，變性94℃ 30 s，退火53.8℃ 30 s，延伸72℃30 s，共40 個循環(huán)，72℃ 7 min，4℃ 5 min。隨機選擇PCR 產(chǎn)物取2 μL 與3 μL 的6×Loading Buffer 混勻，經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠180 V 電泳25 min，以DL2000 為Marker 來標記產(chǎn)物片段的大??；之后使用凝膠成像儀進行照膠，若獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期片段大小一致，根據(jù)TIANquick Midi Purification Kit（DP204-02）說明書對PCR 產(chǎn)物進行純化。

表1 引物序列信息

1.3.4 克隆及DNA 甲基化序列分析 根據(jù)pMD19-T Vector Cloning Kit（6013）說明書，取3.5 μL 純化產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，并轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細胞，涂布于LA 固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。每個樣本挑取3 個陽性單克隆接種至LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR 鑒定后送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.5 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA 取50～100 mg 樣品于液氮中研磨成粉末狀，使用TRIzol 法進行總RNA的提取。使用核酸檢測儀對其濃度與純度進行檢測，使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，根據(jù)5X All-In-One MasterMix 說明書對合格的RNA 樣品進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.6WNT2基因的表達量研究 以GAPDH為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，根據(jù)EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox 說明書進行實時熒光定量PCR，總反應(yīng)體系20 μL：EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，共40 個循環(huán)，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每個樣品均為3 個生物信息學重復(fù)。

1.3.7 統(tǒng)計分析 使用SPSS19.0 軟件獨立樣本T 檢驗對表達量結(jié)果進行差異比較，P<0.05 被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpG 島預(yù)測 通過在線軟件MethPrimer 預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)蘇博美利奴羊WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp的DNA 序列有1 個CpG 島，其具體位置是220～354 bp，長度為135 bp，CpG 島具體位置見圖1。

圖1 WNT2 基因的CpG 島預(yù)測圖

通過在線軟件MethPrimer 預(yù)測發(fā)現(xiàn)WNT2基因的CpG 島，并針對該區(qū)域設(shè)計了甲基化引物，發(fā)現(xiàn)目的片段在160～389 bp，產(chǎn)物大小在230 bp，如圖2 所示，該片段共包含13 個潛在的DNA 甲基化位點，GC 含量為53.85%。

圖2 WNT2 基因甲基化區(qū)域預(yù)測序列

2.2 不同細度蘇博美利奴羊WNT2基因的DNA 甲基化模式分析和序列比對

2.2.1 蘇博美利奴羊WNT2基因經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的擴增結(jié)果 使用引物WNT2-bsp進行擴增，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3 所示，在230 bp處獲得單一的目的條帶，且沒有引物二聚體，符合預(yù)期片段大小，可用于后續(xù)實驗。

圖3 亞硫酸氫鹽修飾后WNT2 基因擴增產(chǎn)物檢測

2.2.2 蘇博美利奴羊WNT2基因的序列比對 對蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp 序列進行DNA 甲基化分析，根據(jù)未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后不被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶的原理，分析不同細度蘇博美利奴羊WNT2基因的甲基化模式，見圖4，經(jīng)序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有13 個CpG 位點，與Meth Primer 軟件預(yù)測的結(jié)果一致。

2.2.3 不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因的DNA 甲基化水平 分別對極細組和極粗組的蘇博美利奴羊WNT2基因挑取3 個陽性單克隆進行測序，經(jīng)序列比對，結(jié)果如圖5 所示。通過計算發(fā)現(xiàn)極細組和極粗組的CpG 位點的DNA 甲基化水平均較高且差異不顯著，分別為92.31%、88.21%。

以極細組的甲基化水平為對照，對每個CpG 位點的DNA 甲基化水平計算，結(jié)果如表2 所示，CpG4、CpG9 以及CpG10 在2 組中的甲基化水平一致，均為93%，而極粗組的CpG2、CpG3 的甲基化水平高于極細組，其余位點的甲基化水平均低于極細組。

2.3 不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因的表達量研究 由圖6 可知，極細組的表達量較極粗組高出1.88 倍（P<0.05），并且WNT2基因在2 組中的mRNA 表達量與甲基化水平的變化趨勢一致。

WNT2基因的每個CpG 位點在不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中的甲基化水平各不相同，其中，CpG11位點在2 組中的甲基化水平差異最大。對極細組與極粗組的10 個蘇博美利奴羊個體的每一個CpG 位點與表達量進行相關(guān)性分析，通過表3 發(fā)現(xiàn)，CpG11 位點的甲基化水平與表達量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P<0.05，r=0.693）。

3 討 論

圖4 WNT2 基因甲基化區(qū)域測序峰圖

圖5 不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的甲基化模式圖

圖6 不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的表達量及甲基化程度

毛囊的發(fā)生發(fā)育對羊毛的產(chǎn)量與質(zhì)量有重要影響，毛囊的發(fā)育過程非常復(fù)雜。WNT 家族編碼大量分泌蛋白，作為信號蛋白在細胞間傳遞，影響細胞的分化、增殖、遷移，參與多種組織器官的發(fā)育[11]。譚強等[12]研究表明，WNT2基因的表達量隨著胎兒發(fā)育逐漸增高，說明WNT2基因是調(diào)控山羊胎兒早期發(fā)育的一個關(guān)鍵因子。趙博昊[13]利用高通量測序技術(shù)篩選出與獺兔毛色相關(guān)的基因及信號通路，通過驗證發(fā)現(xiàn)WNT2基因與毛色形成相關(guān)。FGF5對毛囊的發(fā)育有抑制作用，而馮新宇等[14]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除綿羊皮膚成纖維細胞WNT2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT2基因表達量極顯著下調(diào)，F(xiàn)GF5基因表達量顯著上調(diào)，說明WNT2對FGF5有抑制作用，從而導(dǎo)致WNT2基因敲除后抑制了毛囊的生長發(fā)育，表明WNT2基因?qū)γ业纳L發(fā)育具有促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細組的表達量顯著高于極粗組，表明WNT2基因可能參與羊毛纖維直徑的形成，對羊毛纖維直徑的大小有影響。

基于對DNA 甲基化與基因表達的深入研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在人類的生長發(fā)育、疾病發(fā)展過程中的作用機制逐漸被揭示，同時對動植物DNA 甲基化功能的研究，可為后續(xù)動植物的繁育工作提供改良依據(jù)。Li 等[15]展示了鳥類的全基因組DNA 甲基化圖譜，并揭示了雞的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)雞基因組中的大多數(shù)CpG 島保持未甲基化狀態(tài)。Lan 等[16]在成年山羊中發(fā)現(xiàn)Dnmt3b基因5'區(qū)域的第11 個CpG-二核苷酸基因座的DNA 甲基化與體重之間存在顯著關(guān)聯(lián)。姚力丹等[17]分析了肌肉生長抑制素（MSTN）基因在肌肉和脂肪中的DNA 甲基化模式及mRNA 表達水平，結(jié)果表明巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因DNA 甲基化水平與MSTN基因表達量呈顯著負相關(guān)。Bai 等[18]研究表明遼寧絨山羊毛發(fā)生長初期毛囊中HOXC8外顯子1 的甲基化程度可能參與調(diào)控遼寧絨山羊羊絨纖維的生長。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細組和極粗組中的甲基化程度均較高，為進一步研究WNT2基因與羊毛纖維直徑的關(guān)系提供了基礎(chǔ)資料。

表2 不同細度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的CpG 位點的DNA 甲基化水平 %

表3 WNT2 基因mRNA 表達量與CpG 位點的相關(guān)性

通常情況下，啟動子區(qū)域高度甲基化的基因表現(xiàn)出低的表達水平，而低度甲基化的基因表現(xiàn)出高的表達水平，說明DNA 甲基化會抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程[19-21]。然而，外顯子區(qū)域甲基化水平的作用機制與啟動子區(qū)域有所不同。有研究表明，基因最后一個外顯子的甲基化強度，以及基因的上游和下游區(qū)域的甲基化水平對轉(zhuǎn)錄水平的影響大于啟動子的甲基化水平對轉(zhuǎn)錄的影響[22]。阮亦麒等[23]研究發(fā)現(xiàn)RARRES1基因第1 外顯子的CpG9 與CpG16 的甲基化水平與RARRES1基因在香豬高產(chǎn)仔組的較高表達水平有關(guān)。何小龍等[24]研究發(fā)現(xiàn)烏珠穆沁羊GDF11基因外顯子1 甲基化水平對其表達有促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極粗和極細組中的表達量與甲基化水平的變化趨勢一致，與前人研究[23-24]結(jié)果一致?？赡苁怯捎诒狙芯吭O(shè)計引物選擇了WNT2基因的第5 外顯子區(qū)域，WNT2基因的第5 外顯子區(qū)域是最后一個外顯子，該區(qū)域的DNA 甲基化水平對轉(zhuǎn)錄水平的影響大于啟動子區(qū)域。本研究表明，WNT2基因在2 組中的DNA 甲基化水平均較高。同時，WNT2基因在蘇博美利奴羊極細組的表達量顯著高于極粗組，且CpG11 的甲基化水平與mRNA 表達量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，表明WNT2基因的DNA 甲基化水平促進WNT2基因在蘇博美利奴羊皮膚組織中的表達，并且DNA 甲基化水平對WNT2基因的表達有一定影響，推測蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因通過DNA 甲基化修飾從而調(diào)節(jié)基因的表達，并調(diào)控了蘇博美利奴羊的羊毛纖維直徑，可作為一個候選的表觀遺傳標記。然而，闡明WNT2基因第5 外顯子的DNA 甲基化水平調(diào)控蘇博美利奴羊羊毛生長的分子機制需要進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細組和極粗組中的甲基化程度均較高，且2 組DNA 甲基化程度與表達量水平的變化趨勢一致，同時，CpG11 位點的甲基化水平與mRNA 表達量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，該位點與羊毛纖維直徑有關(guān)，表明WNT2基因的DNA 甲基化水平對羊毛纖維直徑有一定作用，可作為一個候選的表觀遺傳標記。