姜黃素對兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究

趙凌昆，陳麗娟，郭云輝，孫琪，呂紅梅*

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

增生性瘢痕(HS)是創(chuàng)傷修復(fù)的必然產(chǎn)物，嚴重影響機體的正常功能及美觀，給患者心理和身體帶來極大的痛苦。由于其確切發(fā)病機制尚不明確，故目前臨床中無特異性根治方法[1]。外科手術(shù)切除、藥物治療、加壓及激光治療等方法是近些年來臨床上常用的治療HS的方法，雖然取得較好的治療效果，但存在著治療周期長、復(fù)發(fā)率高以及副作用大等缺點[2-3]。故從天然藥物中篩選更為安全、有效的藥物治療更顯尤為迫切。

姜黃素是從我國傳統(tǒng)中藥——姜黃等的根莖中提取得到的多酚類活性物質(zhì)，不僅具有消除炎癥、抵抗自由基、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，還具有抗纖維化的作用[4]，增生性瘢痕即是瘢痕過度纖維化的表現(xiàn)。故本實驗以兔耳瘢痕模型為研究對象，探討姜黃素對增生性瘢痕的治療效果及作用機制，為姜黃素的進一步開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素(美國Sigma公司)；黃凡士林(上海商璽偉康醫(yī)藥用品有限公司)；液體石蠟(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(蕪湖三益制藥有限公司)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；鼠抗人Ki67多克隆隆抗體、兔抗人α-SMA單克隆抗體(英國Abcom公司)；石蠟切片機Leica(德國)；電熱恒溫干燥箱(沈陽市醫(yī)療器械廠)；格蘭仕微波爐(順德格蘭仕微波爐電器有限公司)；顯微鏡(DM 2000)(奧林巴斯株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕模型的建立

清潔級新西蘭大白兔12只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.7 kg，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。根據(jù)李薈元等[5]建立的兔耳增生性瘢痕動物模型方法，3 g/100 mL戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉，75%酒精消毒，嚴格無菌操作，在兔耳腹側(cè)中段沿長軸避開可見血管，做6個直徑為1 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，每個創(chuàng)面間隔1 cm以上，創(chuàng)面深達軟骨層，完整去除軟骨膜，壓迫止血后創(chuàng)面暴露，自行愈合。

1.2.2 實驗分組及給藥

瘢痕完全上皮化后將動物隨機分為3組，瘢痕模型組(B組)不予特殊處理，姜黃素組(C組)涂抹質(zhì)量分數(shù)為10%姜黃素軟膏(通過預(yù)實驗篩選確定，姜黃素∶凡士林∶液體石蠟=1∶7∶2)，地塞米松陽性藥對照組(D組)涂抹地塞米松軟膏。每次用量0.1 g，每日2次，連續(xù)用藥28 d。另留取3只為正常皮膚對照組(A組)。實驗結(jié)束后將白兔處死，每組各獲得標本36個。

1.2.3 HE染色觀察

各組標本用4%甲醛溶液固定，酒精、二甲苯脫水、石蠟包埋，4 μm厚度切片, 按照蘇木素-伊紅(HE)染色操作步驟進行。顯微鏡下觀察各組標本的病理學(xué)改變；低倍鏡下測量疤痕增生指數(shù)(HI)[6]。高倍鏡下計算各組瘢痕中單位面積的成纖維細胞數(shù)目(NA)。

HI=瘢痕最高點到軟骨的垂直距離/正常皮膚到軟骨的距離

1.2.4 免疫組化染色觀察

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，甲醇-過氧化氫液封閉，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，根據(jù)抗體要求，按照免疫組化操作步驟進行(SP法)，滴加抗Ki67多克隆抗體及抗α-SMA單克隆抗體，DAB顯色，出現(xiàn)棕黃色陽性細胞時，終止反應(yīng)，封片固定。高倍鏡(×400)下隨機選取5個部位，采用半定量記分法，根據(jù)陽性細胞的染色強度及陽性細胞百分率進行綜合評分。0分為無色或無細胞染色；1分為淺黃色或陽性細胞≤25%；2分為棕黃色或陽性細胞26%～50%；3分為棕褐色或陽性細胞>50%；二者相加后0～2分為陰性，3～6分為陽性。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

模型組中瘢痕明顯高出周圍正常組織，厚度約為正常皮膚的2.5倍，質(zhì)地較硬，淡紅色；姜黃素組及地塞米松組中瘢痕體積均減小，質(zhì)地變軟，淡粉色，基本接近正常膚色；各組瘢痕均未超出原創(chuàng)傷范圍。

2.2 組織學(xué)觀察

正常組織中成纖維細胞數(shù)目少，密度低，膠原纖維排列整齊。模型組中可見真皮層增厚，大量成纖維細胞及膠原纖維堆積，膠原纖維排列紊亂并伴有炎細胞浸潤；姜黃素組及地塞米松組成纖維細胞及炎細胞明顯減少，膠原纖維排列相對規(guī)則。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果(×200)

2.3 瘢痕增生指數(shù)HI

HI被認為是評估瘢痕形成的最客觀標準，瘢痕增生過程中細胞的增殖，細胞外基質(zhì)的沉積，上皮的增厚，都可以通過它來進行量化描述[6]。模型組中HI顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素組及地塞米松組中HI均較模型組降低，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但二組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組的瘢痕增生指數(shù)見表1。

2.4 成纖維細胞密度NA

模型組中NA顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物治療組中(姜黃素組及地塞米松組)NA均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但二組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組的成纖維細胞密度見表1。

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、成纖維細胞密度的比較

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：Ki-67及α-SMA陽性表達分別位于胞核及胞漿內(nèi)，呈黃色或棕黃色，正常組織中表達極少，模型組織中可見較多的陽性表達，二組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在藥物治療組中，Ki-67及α-SMA表達量均較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但二組之間差異不明顯。具體結(jié)果見表2。

表2 各組兔耳Ki67、α-SMA陽性表達水平變化[n(%)]

3 討論

HS是纖維結(jié)締組織過度增生性疾病，迄今為止，尚無理想藥物治療。我國傳統(tǒng)中藥在治療瘢痕方面有著悠久歷史，如積雪草苷、苦參堿、丹參酮ⅡA、血竭素B、地龍等均在治療瘢痕方面取得良好效果[7]。姜黃是我國常見的一種中藥，《新修本草》中記載姜黃具有活血行氣、通經(jīng)止痛的功效，歸肝、脾經(jīng)。臨床廣泛應(yīng)用于血瘀氣滯諸痛，痹證[8]。姜黃素是姜黃中提取的主要活性成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明姜黃素不僅具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)脂、抗組織損傷等作用，在預(yù)防及治療肝臟，肺臟等器官纖維化疾病中亦具有明顯的效果[4]，因此姜黃素在對抗纖維化疾病中具有潛在的應(yīng)用前景，有望成為治療HS的一線用藥。

在本實驗中，成功建立了兔耳瘢痕模型，每組獲得36個瘢痕創(chuàng)面，具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果表明：姜黃素對兔耳瘢痕有明顯抑制作用，在藥物治療組中(姜黃素組及地塞米松組)瘢痕體積均減小，質(zhì)地變軟，顏色變淺，具有向正常皮膚轉(zhuǎn)化的趨勢，組織學(xué)上也證實了這一結(jié)論，藥物治療后HE切片顯示瘢痕中Fb及炎細胞減少，膠原纖維排列相對規(guī)則，同時HI及NA這些量化指標檢測結(jié)果也提供了強有利的證據(jù)，姜黃素組中HI及NA均較模型組小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

HS作為病理性瘢痕的一種，F(xiàn)b的異常增殖及向MFb轉(zhuǎn)化是HS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[9]。研究表明，在創(chuàng)傷發(fā)生后6 d左右Fb在TGF-β1的誘導(dǎo)作用下向MFb轉(zhuǎn)化。MFb不僅高表達α-SMA，還具有強大的合成和分泌膠原蛋白為主要成分的細胞外基質(zhì)的功能[10]。因此通過α-SMA蛋白的檢測可以反映組織中MFb的數(shù)量。本實驗結(jié)果顯示：α-SMA在正常組織中極少表達5(13.89%)，模型組中大量表達22(61.11%)，二者具有統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)姜黃素治療后，α-SMA蛋白由模型組的22(61.11%)降至13(36.11%)，具有明顯差異，提示姜黃素可以抑制HS中Fb向MFb轉(zhuǎn)化，減少α-SMA的表達。

Ki67是1983年由 Gerdes 等發(fā)現(xiàn)的一種增殖細胞核抗原，是檢測細胞增殖活性最可靠的指標[11]。研究結(jié)果顯示Ki67在正常組織中陽性表達極少3(8.33%)，模型組中可見大量陽性表達25(69.44%)，而姜黃素組及地塞米松組中Ki67表達量分別為8(22.22%)及10(27.78%)，藥物治療組與模型組有明顯差異(P<0.05)，說明模型組中Fb的大量存在與Fb增殖活躍有關(guān)，而姜黃素可以抑制Fb的異常增殖。

目前糖皮質(zhì)激素類藥物是治療HS的首選藥物，但是其副作用大，復(fù)發(fā)率高，不適合長期應(yīng)用，具有局限性[12]。而姜黃素具有藥源豐富、價格低廉、藥效安全穩(wěn)定等優(yōu)點，故深入開展對姜黃素的研究具有重要的理論及現(xiàn)實意義。