金錢蒲組織培養(yǎng)再生體系建立的研究

張可凡，李勇學(xué)，陳 瑤，周 蓉，謝曉玲，鄧自發(fā)

(南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019)

金錢蒲(Acorusgramineus)又稱錢蒲、隨手香，系天南星科菖蒲屬，多年生草本植物，株高10～20 cm，分枝叢生，全株具香氣，主要通過(guò)根莖分株的方式進(jìn)行繁殖[1-5]。金錢蒲具有較高的藥用價(jià)值、園林價(jià)值、文化價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)修復(fù)功能[6,7]，是一種極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的觀賞性植物。對(duì)金錢蒲的研究主要集中在文化和醫(yī)藥價(jià)值上，同時(shí)對(duì)其根莖揮發(fā)油化學(xué)成分和活性的研究也比較廣泛[8-10]，但是在組織培養(yǎng)等快繁技術(shù)開(kāi)發(fā)方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。目前金錢蒲擴(kuò)繁主要采用土培方式，由于該方式培育周期長(zhǎng)，受病蟲(chóng)害等外部環(huán)境因素影響大，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，因此展開(kāi)金錢蒲組培快繁研究和技術(shù)開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

本研究以金錢蒲分蘗莖基部為外植體，對(duì)其組培過(guò)程中的消毒、誘導(dǎo)、增殖、生根和煉苗移栽等環(huán)節(jié)影響因素及關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，從而有效提高金錢蒲組培苗的擴(kuò)繁系數(shù)，建立一種保質(zhì)保量快速有效的金錢蒲組培繁育體系，以滿足市場(chǎng)需求，為金錢蒲種質(zhì)資源的保護(hù)、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用和規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試驗(yàn)材料為金錢蒲，選取分蘗莖基部作為組培外植體。

1.2 材料的消毒處理

先用清水清洗金錢蒲表面污漬，然后剪取分蘗莖基部放入燒杯中，用洗衣粉溶液浸泡20 min，再用蒸餾水沖洗1 h，將材料表面殘留的洗衣粉溶液沖洗干凈，最后將其放置在無(wú)菌室內(nèi)的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。

在無(wú)菌室內(nèi)的超凈工作臺(tái)上，將剪取的分蘗莖基部先用75%乙醇消毒10 s后用無(wú)菌水沖洗3遍，接著用0.1%升汞浸泡8 min后再用無(wú)菌水沖7遍，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.3 不同激素配比對(duì)初代分化芽誘導(dǎo)的影響

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度采用L9(33)正交設(shè)計(jì)，選擇2,4-D、6-BA、NAA 3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度水平，因素水平見(jiàn)表1。將消毒處理后的金錢蒲外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，要求每個(gè)試驗(yàn)處理接種15個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)35 d后觀察記錄，統(tǒng)計(jì)分化芽開(kāi)始時(shí)間、平均芽長(zhǎng)、平均分化芽數(shù)和誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率(%)=(分化芽數(shù)/外植體數(shù))×100%。

1.4 不同激素配比對(duì)分化芽繼代增殖的影響

自初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上繼續(xù)以MS為基本培養(yǎng)基，探究不同質(zhì)量濃度NAA(0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0.5、1、1.5、2 mg·L-1)組合對(duì)繼代增殖培養(yǎng)的影響。當(dāng)外植體初代誘導(dǎo)出4～6片嫩葉時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，多次反復(fù)轉(zhuǎn)接進(jìn)行繼代培養(yǎng)(繼代轉(zhuǎn)接2～3次)，要求每個(gè)試驗(yàn)處理接種15個(gè)分化芽，重復(fù)3次。繼代培養(yǎng)35 d為1個(gè)周期，培養(yǎng)周期末觀察記錄，統(tǒng)計(jì)平均增殖芽數(shù)和增殖系數(shù)(增殖系數(shù)=平均增殖芽數(shù)/接種芽數(shù))。

表1 不同激素配比正交試驗(yàn)(L9(33))

1.5 不同激素配比對(duì)試管苗生根誘導(dǎo)的影響

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，選用NAA、2,4-D和IBA 3種激素對(duì)組培試管苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試管苗生根誘導(dǎo)的激素進(jìn)行篩選。以NAA、2,4-D和IBA 3種激素質(zhì)量濃度為單因素，每個(gè)因素取3水平，以平均生根數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)。當(dāng)繼代增殖培養(yǎng)基上的外植體長(zhǎng)出3～4個(gè)分蘗(增殖出的嫩葉有20～30片)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)入添加有2 mg·L-1活性炭的生根培養(yǎng)基中，每個(gè)試驗(yàn)處理接種15個(gè)試管苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)35 d后觀察記錄，統(tǒng)計(jì)平均生根數(shù)和生根率。

生根率(%)=(生根數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平

1.6 不同移栽基質(zhì)對(duì)無(wú)菌苗移栽的影響

當(dāng)生根培養(yǎng)基中的試管苗誘導(dǎo)出5～10條不小于2 cm的根時(shí)，將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到煉苗室，在閉瓶條件下接受室溫和自然光5～7 d；然后，打開(kāi)組培瓶膜再接受室溫和自然光5～7 d。瓶?jī)?nèi)馴化完之后，從煉苗室移出，用25 ℃左右的清水洗去培養(yǎng)基，再用0.1%多菌靈浸泡根部10～20 min，然后分別移栽于珍珠巖∶蛭石=1∶1、泥炭土∶珍珠巖=1∶1、泥炭土∶蛭石=1∶1這3種移栽基質(zhì)中，要求每個(gè)試驗(yàn)處理接種15個(gè)無(wú)菌苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)35 d后觀察記錄，統(tǒng)計(jì)成活率。

成活率(%)=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%。

1.7 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基添加瓊脂0.7%，蔗糖3%，pH 5.8～6.0；培養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度60%～70%，每天光照14 h，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 22.0分析軟件對(duì)初代和繼代培養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，生根誘導(dǎo)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)初代分化芽誘導(dǎo)的影響

將經(jīng)過(guò)消毒處理后的金錢蒲分蘗莖基部接種到添加有不同濃度配比植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS基本培養(yǎng)基中。一般接種7 d左右分蘗莖基部開(kāi)始分化芽，大概2周后開(kāi)始長(zhǎng)出新葉，35 d左右逐漸趨于穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)其分化的芽數(shù)和芽長(zhǎng)。

從表3可知，不同的激素組合配方對(duì)金錢蒲分蘗莖基部的影響不同，由極差分析中的R值得出，各因素對(duì)分蘗莖基部影響作用的順序?yàn)椋?-BA>NAA>2,4-D。結(jié)果表明，6-BA對(duì)分蘗莖基部初代誘導(dǎo)的影響最大，是誘導(dǎo)分蘗莖基部分化的主要因素，其次是NAA和2,4-D。在設(shè)計(jì)的這9種處理中，處理4(2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1)為最優(yōu)組合，效果最佳，全部分化時(shí)間較短(7 d)，平均分化芽數(shù)最多(3.89個(gè))，平均分化芽長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)(1.10 cm)(誘導(dǎo)效果見(jiàn)圖1)。

表3 不同激素配比對(duì)分蘗莖基部初代誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素配比對(duì)分化芽繼代增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和6-BA，觀察比較其對(duì)金錢蒲分蘗莖基部繼代增殖的影響。研究結(jié)果表明，不同濃度的NAA和6-BA對(duì)分蘗莖基部繼代培養(yǎng)的影響具有明顯差異(表4)。當(dāng)添加6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1時(shí)，其效果最好，平均增殖芽數(shù)最多(13.89個(gè)芽)，增殖系數(shù)最大，達(dá)到了2.67(繼代增殖效果見(jiàn)圖2)。

圖1 初代誘導(dǎo)情況

注：a為第1次繼代培養(yǎng)；b為第2次繼代培養(yǎng)后。圖2 繼代增殖培養(yǎng)情況

表4 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA配合使用對(duì)分蘗莖基部繼代增殖的影響

2.3 不同激素配比對(duì)試管苗生根誘導(dǎo)的影響

為對(duì)比NAA、2，4-D、IBA 3種生長(zhǎng)素在0.1～1 mg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)試管苗生根培養(yǎng)的影響，以NAA(A)、2，4-D(B)、IBA(C)質(zhì)量濃度為因素，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并進(jìn)行了回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析(表5)。

表5 回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析(平均生根數(shù))

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，NAA、2，4-D對(duì)生根誘導(dǎo)平均生根數(shù)的線性效應(yīng)極顯著(p<0.01)，IBA對(duì)平均生根數(shù)的線性效應(yīng)顯著(p<0.05)；因素AB、AC對(duì)平均生根數(shù)的交互影響不顯著，BC對(duì)平均生根數(shù)的交互影響極顯著；因素A2、C2對(duì)平均生根數(shù)的曲面效應(yīng)極顯著，因素B2對(duì)平均生根數(shù)的曲面效應(yīng)顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸，以平均生根數(shù)(Y)為因變量，NAA(A)、2，4-D(B)、IBA(C)為自變量建立回歸方程模型為Y=0.609 50+14.717 00A+8.259 50B+5.819 50C+0.730 00AB-0.930 00AC-2.940 00BC-7.702 00A2-1.572 00B2-3.352 00C2。

圖3 不同激素種類與平均生根數(shù)的響應(yīng)面分析

圖4 生根培養(yǎng)情況

該模型的回歸F值為215.54，經(jīng)擬合檢驗(yàn)，p<0.01，表明該回歸極顯著，模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好。決定系數(shù)(R2)=0.996 4，校正決定系數(shù)(R2adj)為0.991 8，變異系數(shù)越低，模型的置信度越高，表明該模型與實(shí)際的試驗(yàn)擬合程度良好，誤差小，模型選擇合適，說(shuō)明該方程能夠正確反映平均生根數(shù)和不同激素之間的關(guān)系，可以用該模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)來(lái)確定最佳激素配比。

根據(jù)回歸方程Y=0.609 50+14.717 00A+8.259 50B+5.819 50C+0.730 00AB-0.930 00AC-2.940 00BC-7.702 00A2-1.572 00B2-3.352 00C2，繪制不同激素種類與平均生根數(shù)的響應(yīng)面分析圖(圖3)。通過(guò)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件優(yōu)化，獲得最佳激素配比為NAA 0.99 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1+IBA 0.29 mg·L-1，預(yù)測(cè)平均生根數(shù)為15.33個(gè)。為檢測(cè)結(jié)果的可靠性，采用最佳激素配比進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果得出平均生根數(shù)為15.02個(gè)，生根率也達(dá)到了93.33%(生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖4)，因此驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果的正確性，說(shuō)明響應(yīng)面分析法得到的激素配比真實(shí)可靠。

2.4 不同移栽基質(zhì)對(duì)無(wú)菌苗移栽的影響

由表6可知，不同移栽基質(zhì)對(duì)金錢蒲無(wú)菌苗移栽成活率的影響不盡相同，珍珠巖∶蛭石=1∶1的成活率明顯高于其他基質(zhì)，達(dá)到91.11%，且葉片深綠、無(wú)枯葉現(xiàn)象，最適合作為金錢蒲移栽培養(yǎng)的基質(zhì)(移栽效果見(jiàn)圖5)。

表6 不同移栽基質(zhì)上生根苗移栽成活率

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，不同消毒劑和消毒時(shí)間的選擇對(duì)外植體污染的影響較大，正確選擇消毒劑的種類、濃度和處理時(shí)間可以有效降低污染率，減少組織細(xì)胞死亡，提高外植體的存活率和誘導(dǎo)率，達(dá)到最好的誘導(dǎo)效果[11-18]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分蘗莖基部最適宜作為金錢蒲組培外植體，且采用75%酒精10 s+0.1%升汞8 min的消毒效果最佳。

圖5 移栽至珍珠巖∶蛭石=1∶1基質(zhì)中培養(yǎng)35 d的生根苗

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同基本培養(yǎng)基和不同激素組合配方對(duì)金錢蒲分蘗莖基部初代誘導(dǎo)和繼代增殖的影響不盡相同，但總體趨勢(shì)同文獻(xiàn)報(bào)道一致：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值低時(shí)，有利于芽的形成[19,20]；誘導(dǎo)生根的基本培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度的降低，有利于根的分化[21]，而生根誘導(dǎo)成敗的關(guān)鍵是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度之間的配比。本項(xiàng)研究中分蘗莖基部初代誘導(dǎo)的最佳配方為：MS+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；繼代培養(yǎng)的最佳配方為：MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；生根誘導(dǎo)的最佳配方為1/2 MS+NAA 0.99 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1+IBA 0.29 mg·L-1+活性炭2 g·L-1。煉苗最好的方式是：在閉瓶條件下接受室溫和自然光5～7 d；然后，打開(kāi)組培瓶膜再接受室溫和自然光5～7 d。移栽基質(zhì)以珍珠巖∶蛭石=1∶1效果最好，最適合作為金錢蒲移栽培養(yǎng)的基質(zhì)。

研究表明多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中全面試驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)是可獲得更多的信息量，但需要最多的試驗(yàn)次數(shù)；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)布點(diǎn)均衡、結(jié)果直觀容易分析，可以實(shí)現(xiàn)以最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到與大量全面試驗(yàn)等效的結(jié)果，是一種高效、快速而經(jīng)濟(jì)的多因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。因此，在植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)上多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法；而響應(yīng)面設(shè)計(jì)可以得到高精度的回歸方程，并能得到精確的因素水平值，減少最佳條件下效應(yīng)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的偏差[22]。在本項(xiàng)研究的初代誘導(dǎo)階段采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，繼代增殖階段采用全面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，生根培養(yǎng)階段嘗試采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從研究結(jié)果可以看出3種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都能較好的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，但和全面試驗(yàn)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能提供更多的信息，因此在后續(xù)研究中將加強(qiáng)不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)缺點(diǎn)分析，根據(jù)因素和水平的設(shè)置情況選擇更為有效的實(shí)驗(yàn)方案達(dá)到事半功倍的效果。

相比于傳統(tǒng)土培繁育技術(shù)，金錢蒲組培快繁技術(shù)繁育速度較快，生長(zhǎng)周期較短，1個(gè)周期的繁殖倍數(shù)可達(dá)4倍左右；無(wú)菌苗健壯，少病蟲(chóng)害，根系發(fā)達(dá)，具有很強(qiáng)的生命力；實(shí)現(xiàn)了金錢蒲的高密度栽培，既省時(shí)、省力、有效率，又節(jié)約了土地資源和生產(chǎn)成本，而且解決了養(yǎng)分吸收利用率低下的問(wèn)題。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)金錢蒲組織培養(yǎng)外植體選擇、消毒處理、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等方面進(jìn)行的研究，基本找到了金錢蒲組織培養(yǎng)快繁適宜外植體、滅菌條件和培養(yǎng)基配方，初步建立了金錢蒲組織培養(yǎng)快繁體系，為實(shí)現(xiàn)金錢蒲規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和大面積的推廣奠定基礎(chǔ)。