電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊改善慢性坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠疼痛及對GFAP/p38MAPK信號通路的影響*

金 弘，劉婷婷，劉樹民，陳英華，孫曉偉，祝鵬宇

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain, NP)主要臨床特征為痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和痛覺超敏，多是由于疾病引起軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)受損而發(fā)病[1]。臨床常見于脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和坐骨神經(jīng)急慢性壓迫、糖尿病等引起的周圍神經(jīng)損傷[2]。神經(jīng)病理性疼痛目前被普遍認為是一種難治性的疼痛狀態(tài)，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，并且給社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔。

神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前有報道外周及中樞敏化、痛覺受體表達上調(diào)、促炎因子釋放和膠質(zhì)細胞活化等機制均可能直接或者間接參與了其疼痛的發(fā)生和發(fā)展[3]。其中，神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化被認為占據(jù)重要地位，當神經(jīng)細胞受損時，神經(jīng)膠質(zhì)細胞通過相關(guān)受體表達而被激活，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)過度釋放，進而介導(dǎo)了神經(jīng)活性物質(zhì)及多種促炎細胞因子過度表達[4]。而p38MAPK信號通路被認為是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機制的關(guān)鍵因子之一，其活化后能夠抑制痛覺信號傳導(dǎo)，并且促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化[5]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊能夠顯著改善神經(jīng)病理性疼痛患者疼痛癥狀[6]，為進一步觀察GFAP/p38MAPK信號通路在電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊鎮(zhèn)痛作用中的機制，本研究擬建立慢性坐骨神經(jīng)損傷(CCI)模型大鼠，觀察不同治療方法對大鼠疼痛及GFAP/p38MAPK信號通路相關(guān)因子表達的影響，為本療法的臨床應(yīng)用提供堅實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

采用隨機數(shù)字表法將90只購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[動物合格許可證號:SCXK(黑)2008004]的健康清潔級雄性SDSD(Sprague Dawley)大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針組、中藥組和針藥組，大鼠體質(zhì)量(250±30)g，每組根據(jù)干預(yù)時間點不同分為3個亞組，分別為3 d、7 d和14 d組，每個亞組共6只大鼠。大鼠購買后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗，保證室溫21～24℃，相對濕度50%～70%，室內(nèi)12 h交替照明，除手術(shù)前禁食24 h外，其余時間大鼠自由進食和水。實驗過程中對大鼠的處置均按照國際最新的實驗動物使用和關(guān)懷指南進行。

1.2 主要實驗儀器和試劑

1.2.1 儀器 大鼠熱痛刺激儀(BME-410A型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京)；電泳系統(tǒng)(042BR14167，BIO-RAD，美國)；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon-4100，天能科技，中國)；華佗針灸針(蘇州醫(yī)療設(shè)備廠，中國)；電針儀(KWD-801，英迪,中國)。

1.2.2 試劑 GFAP(bs-0199R，北京博奧森)；p-p38 MAPK(bs-0636R，北京博奧森)；身痛逐瘀膠囊(規(guī)格：0.35 g/粒，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，批號:20110513)。

1.3 動物模型制備

本研究所選擇的模型是慢性坐骨神經(jīng)損傷模型(CCI)，參照Bennett等[7]的方法，大鼠術(shù)前禁食不禁水24 h，稱重后按照0.35 mL/100 g的劑量用水合氯醛腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，將其固定到自制的木板上，手術(shù)部位選擇為左側(cè)后肢大腿部，局部剃毛、備皮后用碘伏消毒，在大鼠股骨中上約1/3處切開，然后用眼科鑷鈍性分離肌肉及皮下筋膜，暴露坐骨神經(jīng)主干后，用事先備好并消毒完成的鉻制羊腸線(規(guī)格為4-0號)結(jié)扎坐骨神經(jīng)干，以1.0 mm間距均勻結(jié)扎4道。術(shù)后縫合肌肉及皮膚，其中，假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)而不用羊腸線結(jié)扎，其余各組均按照上述方法結(jié)扎。術(shù)后待動物完全蘇醒后觀察其自發(fā)性疼痛行為學(xué)，觀察其是否有過度的舔足、縮足、跛行和損傷側(cè)后肢負重能力降低等自發(fā)性疼痛的表現(xiàn)；術(shù)后3 d對其進行機械縮足反射潛伏期測定，以上述結(jié)果較術(shù)前均顯著且穩(wěn)定的下降超過30%為模型建立成功的標志。

1.4 治療方法

1.4.1 假手術(shù)組 手術(shù)僅暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎，術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，給予與中藥組同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，未經(jīng)其他任何治療。

1.4.2 模型組 術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，給予與中藥組同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，未經(jīng)其他任何治療。

1.4.3 電針組 選穴：選擇模型大鼠損傷側(cè)環(huán)跳穴和陽陵泉穴。操作方法：將大鼠用自制的木板捆綁后，上述穴位局部及針具常規(guī)消毒，選擇規(guī)格為0.25 mm×25 mm一次性無菌針灸針，快速將針刺入皮下，進針深度為5 mm[8]。然后將電針儀的正極和負極分別接到環(huán)跳穴和陽陵泉穴上，波形選擇參照前期研究結(jié)果，選擇疏密波，電針頻率為2 Hz/100 Hz，然后調(diào)節(jié)控制電流的旋鈕，以調(diào)節(jié)電針電流，直至大鼠下肢針刺局部肌肉輕微顫動，并且大鼠未劇烈掙扎，即為針刺電流大小，每次針灸治療時間為30 min，每日針刺治療1次。

1.4.4 中藥組 中藥給藥的劑量參照前期研究結(jié)果[9]，實驗開始前制備身痛逐瘀膠囊藥物混懸液，具體方法是取藥粉1.64 g，加入0.9%氯化鈉注射液并定容至100 mL，置于4℃冷藏保存?zhèn)溆?。灌胃時，根據(jù)查閱文獻及預(yù)實驗結(jié)果，給予15 mL/kg給藥容積灌胃，以確保療效及實驗動物能夠耐受。每日灌胃1次。

1.4.5 針藥組 給予電針和中藥聯(lián)合治療，方法及療程同電針組和中藥組。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 熱縮足反射潛伏期的檢查方法 本研究檢測大鼠熱縮足反射潛伏期(Thermal withdrawal latency,TWL)的方法是利用BME-410A型熱輻射刺激儀對被檢查大鼠足底進行照射[10]，記錄各組大鼠熱縮足反射潛伏期，計算方法是以儀器開始照射至大鼠出現(xiàn)回避所用時間即為其TWL，實驗過程中，事先將大鼠置于箱內(nèi)適應(yīng)30 min，確保箱內(nèi)溫度保持恒定，以免影響實驗結(jié)果。為了減少誤差，研究過程中對每只大鼠TWL檢測3次，每次照射間隔時間為25 s，計算每只大鼠3次數(shù)據(jù)的平均值，即為其熱縮足反射潛伏期。

1.5.2 動物取材及檢測 實驗動物在各時間點檢查完機械縮足反射閾值后，稱重后按照0.35 mL/100 g的劑量用水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露左心室，用20 mL注射器插入左心室，剪開左心耳，多聚甲醛灌注至肺臟變白后取出長度約為1.5 cm的L4～L6段脊髓組織，置于1.5 mL凍存管中，液氮凍存后置于-80℃冰箱備用。Western blot檢測時稱取100 mg置于-80 ℃凍存的脊髓組織，經(jīng)裂解、研磨和離心等步驟提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白質(zhì)上樣樣品，電泳電壓和時間分別為濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，60 min；轉(zhuǎn)膜后37℃水浴震蕩1 h封閉，根據(jù)各抗體說明書按比例將一抗稀釋，將膜放入一抗中，在4 ℃條件下孵育過夜；取出膜后，用TBST清洗5 min×3次，加入HRP標記的二抗，稀釋比例為1∶2 000，在37 ℃條件下孵育1 h，然后以TBST清洗10 min×3次。最后經(jīng)ECL發(fā)光液曝光，并采用quantity one分析軟件分別測量目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，以兩者的比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠熱縮足反射潛伏期檢測結(jié)果

結(jié)果表明，模型組大鼠TWL明顯低于手術(shù)之前，術(shù)后3 d、7 d和14 d 3個時間點均較假手術(shù)組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；電針組、中藥組及針藥組給予相應(yīng)治療后，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠TWL顯著升高，術(shù)后3 d、7 d和14 d 3個時間點均較模型組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針藥組大鼠TWL顯著升高，術(shù)后3 d、7 d和14 d 3個時間點均較電針組和中藥組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 各組大鼠脊髓組織GFAP蛋白表達

結(jié)果可見，模型組大鼠GFAP在脊髓組織中的表達在術(shù)后3 d、7 d和14 d 3個時間點均較假手術(shù)組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；電針組、中藥組及針藥組給予相應(yīng)治療后，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠GFAP在脊髓組織中的表達各時間點均較模型組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針藥組大鼠GFAP在脊髓組織中的表達各時間點均較電針組及中藥組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖1。

表1 各組大鼠TWL檢測結(jié)果

表2 各組大鼠GFAP相對表達量檢測結(jié)果

注：1.假手術(shù)組；2.模型組;3.電針組；4.中藥組；5.針藥組。圖1 各組CCI模型大鼠脊髓組織GFAP蛋白表達

2.3 各組大鼠脊髓組織p-p38蛋白表達

結(jié)果可見，模型組大鼠p-p38在脊髓組織中的表達在術(shù)后3 d、7 d和14 d 3個時間點均較假手術(shù)組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；電針組、中藥組及針藥組給予相應(yīng)治療后，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠p-p38在脊髓組織中的表達各時間點均較模型組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針藥組大鼠p-p38在脊髓組織中的表達各時間點均較電針組及中藥組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

注:1.假手術(shù)組；2.模型組;3.電針組；4.中藥組；5.針藥組。圖2 各組CCI模型大鼠脊髓組織p-p38蛋白表達

表3 各組大鼠脊髓組織p-p38蛋白表達量檢測結(jié)果

3 討論

CCI模型是目前用于研究神經(jīng)病理性疼痛較為常用的模型之一，大鼠造模成功后，其病理改變與坐骨神經(jīng)痛較為相似，因此是研究中醫(yī)學(xué)中“痹癥”“腰腿痛”[11]等疾病理想的動物模型。該類疾病在中醫(yī)學(xué)典籍中有記載，對其癥狀的描述與現(xiàn)在臨床所見也較為一致，針灸療法是醫(yī)籍記載中治療“腰腿痛”的重要方法之一，可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》中。由坐骨神經(jīng)慢性壓迫所導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛,臨床表現(xiàn)為腰部壓痛或不自主疼痛，并常伴有沿著坐骨神經(jīng)分布區(qū)域的放射性疼痛為主，最典型的表現(xiàn)就是臀部、大腿以及小腿后外側(cè)疼痛?！鹅`樞·經(jīng)脈》篇記載，足太陽膀胱經(jīng)循行過程中，支脈經(jīng)過髀樞后，沿著髀外后廉到達腘中，下貫踹內(nèi)；而足少陽膽經(jīng)直行的經(jīng)脈下合髀厭中，向下經(jīng)過髀陽，出于膝外廉，下行至外輔骨之前，向下到達絕骨之端，下出外踝之前。因此，中醫(yī)學(xué)理論認識到可以選擇足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)的穴位治療該病。至現(xiàn)代，越來越多的研究采用數(shù)據(jù)挖掘的方法探討臨床常見疾病針灸選穴及處方規(guī)律，結(jié)果也提示足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)的穴位使用頻率較高[12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)一直致力于經(jīng)絡(luò)實質(zhì)的研究，其中，經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)相似性較高的理論占有重要地位，在人體足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)巡行部位下可見坐骨神經(jīng)主干及其分支分布，而足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)的穴位較多分布在上述神經(jīng)的體表投影之上[13]。在上述兩經(jīng)的穴位中，環(huán)跳穴與陽陵泉穴不論是從中醫(yī)臨床還是現(xiàn)代解剖學(xué)研究角度看均為治療本病重要穴位，環(huán)跳穴為足少陽和足太陽經(jīng)交會穴，定位于臀外側(cè)部，針刺能疏通兩經(jīng)經(jīng)氣，其深部正當坐骨神經(jīng)，主治腰腿疼痛，《針灸甲乙經(jīng)》云：“腰脅相引痛急……脛痛不可屈伸……環(huán)跳主之。”環(huán)跳穴解剖結(jié)構(gòu)依次經(jīng)皮膚、皮下組織和臀大肌到達深部坐骨神經(jīng)，針刺能夠調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)功能，減輕疼痛癥狀。陽陵泉穴為合穴、膽經(jīng)下合穴及八會穴之筋會，其下為腓總神經(jīng)分支，針刺能調(diào)節(jié)足少陽經(jīng)經(jīng)氣。

GFAP是僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞中的一種中間絲蛋白，可以作為星形膠質(zhì)細胞活化的標志物。而星形膠質(zhì)細胞活化又會引起機體炎癥因子等一系列反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛模型中GFAP表達升高能夠誘發(fā)TNF-α等炎癥因子表達上調(diào)[14-15]。因此，本研究選擇GFAP作為觀察電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊鎮(zhèn)痛作用的觀察指標。p38MAPK 信號通路激活通過外周機制參與神經(jīng)病理性疼痛主要是通過與受損神經(jīng)細胞進行直接或者間接耦聯(lián)，使受損神經(jīng)細胞的傳入神經(jīng)元異常放電被抑制，從而降低受損神經(jīng)纖維末梢傷害性感受器異常升高的興奮性[16]。而p38MAPK信號通路激活通過中樞機制參與神經(jīng)病理性疼痛主要是能夠抑制痛覺信號的傳導(dǎo)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化以及異常興奮的神經(jīng)元的可塑性。主要通過減少脊髓背角興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、增強對受損神經(jīng)纖維相應(yīng)節(jié)段脊髓背角神經(jīng)元的抑制等發(fā)揮作用。由此可見，p38MAPK/GFAP信號通路相關(guān)指標可能是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程中的關(guān)鍵因子。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠各時間點TWL值較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；電針組、中藥組及針藥組各時間點TWL較模型組顯著升高(P<0.05)；針藥組大鼠各時間點TWL較電針組和中藥組顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果表明，模型組大鼠各時間點GFAP、p-p38MAPK蛋白表達較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；電針組、中藥組及針藥組各時間點GFAP、p-p38MAPK蛋白表達較模型組顯著升高(P<0.05)；針藥組大鼠各時間點GFAP、p-p38MAPK蛋白表達較電針組和中藥組顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明，慢性坐骨神經(jīng)損傷后脊髓組織中GFAP、p-p38蛋白表達升高，可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生過程；給予電針、中藥以及針藥聯(lián)合治療均能顯著抑制脊髓組織GFAP、p-p38蛋白表達，其中，尤以針藥組療效更為顯著。綜上所述，電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊能夠減輕CCI模型大鼠疼痛反應(yīng)，其機制可能與下調(diào)脊髓組織中GFAP和p-p38MAPK蛋白表達有關(guān)。