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    基于“熱證可灸”研究麥粒灸對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜屏障的影響*

    2020-09-17 07:24:30謝宇鋒余云進(jìn)楊錦蘭楊宗保
    針灸臨床雜志 2020年7期
    關(guān)鍵詞:麥粒屏障黏液

    謝宇鋒,余云進(jìn),楊錦蘭,陳 赟,馮 軍△,楊宗保

    (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東 深圳 518034; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006;3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院,福建 廈門 361005)

    胃熱證主要表現(xiàn)為胃火熾盛、胃脘灼痛等實(shí)熱癥狀,是熱證中的典型病證。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,胃熱證大鼠的胃黏膜組織出現(xiàn)損傷、炎性病變等病理學(xué)改變[1-2],故胃熱證與胃黏膜損傷的相關(guān)病變具有一致性。灸法作為中醫(yī)的特色療法,具有適應(yīng)癥廣泛、便于使用的特點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,灸法對(duì)胃黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用[3-4]。古往今來,雖然灸法用于治療熱證的理論探討和實(shí)踐諸多,但因其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)開展較少,具體的作用機(jī)制尚未揭示。

    胃黏膜屏障對(duì)胃黏膜損傷具有防御作用,其防御機(jī)制由黏液-碳酸氫鹽屏障、黏膜屏障等相互協(xié)調(diào)而成[5]。三葉因子2(Trefoil Factor Family 2,TFF2)是胃黏膜的重要保護(hù)因子,一定程度上反應(yīng)了胃黏膜屏障的防御功能。據(jù)此,本研究擬通過研究麥粒灸對(duì)胃熱證胃黏膜損傷大鼠胃黏膜屏障的影響,以闡釋麥粒灸對(duì)胃黏膜保護(hù)作用的機(jī)制及“熱證可灸”理論的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    清潔級(jí)雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(150±20)g,購(gòu)買自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司[許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005],飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn),室溫控制在20~22℃,相對(duì)濕度65%~70%,自然光明暗周期,自由飲食。

    1.2 主要儀器與試劑

    1.2.1 儀器 勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司,型號(hào):IKA T10 basic);高速低溫離心機(jī)(SCILOGBX,型號(hào)D3024R);低速離心機(jī)(SCILOGBX,型號(hào):S1010E);基因擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):ETC811);超微量分光光度計(jì)(NannoVue,型號(hào):NanoVue Plus);熒光定量PCR儀(天隆科技,型號(hào):Gentier96E);GloMax酶標(biāo)儀(Promega,型號(hào):GM3030);病理切片機(jī)(Leica,型號(hào):CM1850);智能生物顯微鏡(奧林巴斯Olympus公司,型號(hào):BX53)。

    1.2.2 試劑 辣椒粉(泰州春和源食品有限公司,許可證號(hào):SC10332128102093);無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20190213);TFF2 ELISA試劑盒(Elabscience科技生物公司,貨號(hào):R1873);RNA提取試劑盒(艾德萊生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):RN03);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO,貨號(hào):FSQ-101);無毒性核酸染色劑[生物工程(上海)股份有限公司,貨號(hào):EA26BA0029]。

    1.3 造模與分組

    適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、麥粒灸組。胃熱證胃黏膜損傷模型制備:參照ZOU Z J等[6]方法進(jìn)行造模。將80 g辣椒干粉混入1 L的純水中,經(jīng)120目篩過濾后制成辣椒混懸液(80 mg/mL)。模型組大鼠、麥粒灸組大鼠灌胃辣椒混懸液(10 mL/kg),每天經(jīng)口灌胃2次,連續(xù)6 d,第6天灌胃結(jié)束后,大鼠禁食不禁水12 h,于第7天灌胃無水乙醇(1 mL)1次。結(jié)束后3 h大鼠恢復(fù)自由飲食。

    1.4 干預(yù)方法

    1.4.1 選穴方法 根據(jù)課題組前期研究艾灸干預(yù)胃熱證胃黏膜損傷機(jī)制,麥粒灸組治療選用足陽明胃經(jīng)梁門、足三里為治療穴位[7],參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]對(duì)大鼠的穴位定位。大鼠梁門穴位于腹部正中線與乳頭之間連線的中點(diǎn),臍上約20 mm;大鼠足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處。將所選穴位穴區(qū)使用脫毛膏脫毛、并用濕棉簽將鼠毛擦拭干凈,隨后對(duì)穴區(qū)使用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記。

    1.4.2 艾灸方法 造模結(jié)束后第2天開始治療。將所有麥粒灸組大鼠仰臥朝上用鼠板固定,用鑷子放置麥粒于穴位上(將1 mg純艾絨捏制為基底部2.5~3.0 mm、高度4~5 mm的麥粒),線香點(diǎn)燃,每個(gè)穴位共灸7個(gè)麥粒,每個(gè)麥粒的燃燒時(shí)間為10~12 s,期間用紅外線測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)施灸部溫度,溫度控制45~48℃。麥粒灸1次/d,共7 d。正常組和模型組大鼠同樣捆綁固定,不做麥粒灸治療。

    1.5 樣本采集

    所有組別大鼠于第7天麥粒灸治療結(jié)束后禁食不禁水,12 h后,經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠,用手術(shù)器械剖開大鼠腹部,充分暴露腹主動(dòng)脈并取血5 mL,血漿于常溫靜置1 h后,離心5 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min),離心后用取使用移液槍將血清吸取,移置于凍存管,并放入-80℃冰箱保存,備用于ELISA檢測(cè)。用手術(shù)剪將大鼠全胃取出分離,沿胃大彎剪開,在生理鹽水中洗凈,隨后充分展開胃黏膜,觀察胃黏膜情況,將胃黏膜組織分成2份,一份放入10%多聚甲醛中固定24~48 h,包埋、切片、染色。另一份胃黏膜組織迅速置入液氮冷凍保存,1 h后移入-80℃冰箱,用于QT-PCR檢測(cè)。

    1.6 觀察指標(biāo)

    1.6.1 大鼠一般行為學(xué)觀察 ①外觀:唇、舌、趾、爪、耳、毛發(fā)顏色;②精神活動(dòng)狀態(tài):精神狀態(tài)正常,喜靜,喜動(dòng),興奮,叫聲嘶啞或響亮;③大小便情況:小便色黃或色清,大便正常、秘結(jié)或稀溏。

    1.6.2 胃黏膜組織病理學(xué)光鏡 胃黏膜組織在固定結(jié)束后進(jìn)行梯度酒精脫水、包埋、二甲苯透明、切片。隨后采用HE染色,在400倍光鏡下觀察胃黏膜組織病理形態(tài)并采集圖片。

    1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量(QT-PCR)檢測(cè)胃黏膜組織TFF2、腫瘤壞死因子(TNF-α) 稱取約100 mg組織樣品,加液氮研磨,用1 mL trizol室溫裂解5 min,4℃ 12 000 rpm離心10 min;取上清,按常規(guī)方法提取總RNA,隨后進(jìn)行RNA濃度測(cè)定,取1 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,總體系10 μL,制備cDNA模板。按照說明書進(jìn)行TFF2 mRNA、TNF-α mRNA的RT-PCR檢測(cè),以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,引物序列見表1,用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)定TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)Ct值,將獲得目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值,得到△Ct值后,采用2-△△Ct方法[9]分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    表1 RT-PCR檢測(cè)引物信息表

    1.6.4 血清TFF2含量檢測(cè) ELISA測(cè)定血清TFF2含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠一般行為學(xué)比較

    正常組大鼠毛發(fā)光亮,外觀顏色正常,精神狀態(tài)好,大小便情況無異常;模型組大鼠的毛發(fā)發(fā)黃,唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅,喜動(dòng),暴躁,叫聲嘶啞,小便色黃,大便干結(jié)量少;麥粒灸組大鼠較模型組大鼠好轉(zhuǎn),外觀顏色有所改善,大小便情況較正常。

    2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)比較

    正常組胃黏膜皺襞完整、結(jié)構(gòu)清晰、層次分明,未見損傷或脫落;模型組胃黏膜出現(xiàn)皺襞萎縮、上皮細(xì)胞脫落壞死,細(xì)胞間隙增寬,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);麥粒灸組胃黏膜皺襞破損有所恢復(fù),細(xì)胞結(jié)構(gòu)及固有腺體基本正常,炎癥浸潤(rùn)減輕。見圖1。

    注:A、B、C分別為正常組、模型組、麥粒灸組。圖1 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)結(jié)果(400×)

    2.3 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)比較

    相比正常組,模型組大鼠胃黏膜組織中的TFF2 mRNA含量表達(dá)降低(P<0.01)、TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.01),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在麥粒灸組中TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)較模型組接近正常組(P<0.01或P<0.05),結(jié)果顯示干預(yù)后含量得到有效逆轉(zhuǎn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖2。

    表2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量

    注:a為TFF2 mRNA,b為TNF-α mRNA。圖2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)量(n=8)

    2.4 各組大鼠血清TFF2含量比較

    相比正常組,模型組大鼠的血清TFF2含量表達(dá)降低,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);在麥粒灸組中的表達(dá)較模型組接近正常組,與模型組相比,麥粒灸組表達(dá)量差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

    表3 各組大鼠血清TFF2含量變化

    3 討論

    灸法治療熱證屬于反佐治法,早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便提出:“寒熱虛實(shí),火當(dāng)自之”,《素問·六元正紀(jì)大論》云:“火郁發(fā)之”,均為“熱證可灸”奠定了理論基礎(chǔ)。歷代不少醫(yī)家對(duì)“熱證可灸”均付諸于實(shí)踐,如金元四大家之一的朱丹溪在針灸臨床中運(yùn)用“灸治實(shí)熱證”和“灸治虛熱證”[10],《千金翼方》則記載:“胃中熱,灸三里三十壯?!笔埂盁嶙C可灸”得到佐證和發(fā)展。至現(xiàn)代研究則揭示,艾灸能從抗感染、體液代謝、中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平和免疫功能等調(diào)節(jié)作用于熱證[11]。麥粒灸是灸法的分支之一,是用麥粒狀大的艾柱直接灸的一種方法,具有灸量大、療效顯著的特點(diǎn),相比傳統(tǒng)艾灸,麥粒灸溫?zé)嵋鸬淖仆锤袦p小、瘢痕形成相對(duì)少、適應(yīng)病癥廣泛、易于被患者所接受。在主治功能上,麥粒灸具有既能祛寒又可泄熱的雙向性特點(diǎn)[12]。本課題組早期的研究也表明,艾灸足陽明胃經(jīng)穴“梁門”“足三里”對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷的修復(fù)有促進(jìn)作用[7],但灸法治療熱證的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究,所以本研究以胃黏膜屏障為切入點(diǎn),研究麥粒灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

    胃黏膜屏障主要包括胃黏液屏障和胃黏膜上皮屏障。而胃黏液屏障在胃黏膜屏障中起著核心的作用,既可以使胃黏膜上皮對(duì)胃內(nèi)容物產(chǎn)生機(jī)械損傷和防御作用,又可以抑制胃酸和胃蛋白酶,使胃黏膜上皮的被侵蝕減少。胃黏液屏障主要包括黏蛋白、水、電解質(zhì)、三葉肽(Trefoil factor family,TFFs)以及脂類,覆蓋于胃黏膜上皮細(xì)胞表面[13]。TFFs是胃黏液屏障的主要組成成分之一,包含了乳癌相關(guān)肽(pS2或TFF1)、解痙多肽(SP或TFF2)和腸三葉因子(ITF或TFF3)[14]。作為黏液層的一個(gè)主要組成成分,TFFs可以將胃黏液層中的另一個(gè)重要組成成分黏蛋白連接起來,使單獨(dú)的黏蛋白形成相互重疊、相互穿插的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),從而使黏液凝膠層的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,從而對(duì)胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)作用[15]。Thim L等[16]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)TFFs含量下降,會(huì)導(dǎo)致胃黏膜的黏蛋白結(jié)合形成的多聚體下降,胃黏液凝膠結(jié)構(gòu)變得松散、黏液層萎陷。因此,TFFs的含量可以作為反映胃黏液屏障功能的重要指標(biāo)。TFF2是三葉因子家族中的重要成員,主要分布在胃竇和十二指腸等消化性潰瘍易發(fā)部位。有研究表明,非甾體藥物誘導(dǎo)的潰瘍?cè)赥FF2基因敲除的小鼠中更為敏感[17]。相關(guān)研究表明,給予外源性的TFFs可以減輕NSAIDs、乙醇以及應(yīng)激導(dǎo)致的胃黏膜損傷,也可以促進(jìn)傷口愈合的速度[18-19],在體內(nèi)出現(xiàn)損傷時(shí),TFF2能通過細(xì)胞遷移以保護(hù)胃黏膜受損[20]。因此,TFFs不僅可以反映胃黏膜屏障的功能,而且是重要的胃黏膜保護(hù)因子。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃熱證證候下大鼠毛發(fā)發(fā)黃,唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動(dòng)、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃、大便干結(jié)量少,處于機(jī)能亢進(jìn)狀態(tài)。胃火熾盛則耗傷津液,大鼠出現(xiàn)口渴多飲、叫聲嘶啞、小便色黃和大便秘結(jié);胃火上炎,血得熱則行,毛細(xì)血管充血,可見大鼠唇、舌、趾、爪和耳顏色偏紅。因此胃熱證候下大鼠出現(xiàn)多種熱證反應(yīng)。而經(jīng)麥粒灸干預(yù)后,大鼠毛發(fā)發(fā)黃,唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動(dòng)、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃和大便干結(jié)量少等胃熱表現(xiàn)的證候特征均得到緩解。研究結(jié)果證明胃熱證大鼠出現(xiàn)胃黏膜損傷[2],本實(shí)驗(yàn)中組織病理學(xué)也進(jìn)一步驗(yàn)證此觀點(diǎn),經(jīng)麥粒灸干預(yù)后胃黏膜各層結(jié)構(gòu)趨向完整,炎癥細(xì)胞減少,未見明顯出血點(diǎn)或出血灶形成,在組織病理學(xué)層面驗(yàn)證麥粒灸對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷具有修復(fù)作用。但作用機(jī)理并不可知。因此針對(duì)胃黏膜組織屏障保護(hù)功能,借助QT-PCR技術(shù),對(duì)胃黏膜組織中的TFF2、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較,胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA表達(dá)量和血清中TFF2含量顯著下降,胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào),而艾灸胃經(jīng)穴則可以上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA的表達(dá)量和血清中TFF2含量,下調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量。說明艾灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用可能與上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2的水平相關(guān)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)一般行為學(xué)觀察、組織病理學(xué)以及胃黏膜屏障保護(hù)因子檢測(cè),認(rèn)為胃熱證證候下胃黏膜屏障會(huì)受到破壞,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),麥粒灸可調(diào)節(jié)大鼠胃熱證不適癥狀,改善胃黏膜破損,提高胃黏膜屏障保護(hù)因子水平,從而促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù),熱證可灸具有可行性。

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