針刺對(duì)慢性溫和刺激大鼠糞便代謝的影響*

徐雪嬌，李天英，湯思喬，王慧麗，王瑜萌欣，王瑞琪，徐英凱，何秀麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥的治療一直是全球范圍關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。針刺在抑郁癥的治療中有著顯著的優(yōu)勢(shì)，但其機(jī)制不明[2-3]。隨著“微生物-腸-腦”軸理論的興起，其在神經(jīng)精神疾病的研究領(lǐng)域熱度不斷增加[4]。腸道中存在著龐大的微生物群落，這些微生物依附于腸道生存，其代謝產(chǎn)物在人體中也起到至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究針刺3周中對(duì)抑郁大鼠糞便代謝的調(diào)節(jié)，并找尋變化一致代謝物的所在通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)于哈爾濱光大動(dòng)物養(yǎng)殖中心。品系：SD大鼠。性別：雄性。數(shù)量：30只。實(shí)驗(yàn)室溫度保持在24℃左右，正常晝夜節(jié)律。

1.2 設(shè)備與試劑

GC-MS平臺(tái)(Agilent，7890A/5975C);冷凍離心機(jī) (美國(guó)Thermo) ;-80℃冰箱(青島海爾);移液器(德國(guó)Eppendorf)，漩渦混勻器(型號(hào)：QL-901，其林貝爾儀器公司);甲醇(德國(guó)CNW公司,批號(hào)：Q4891440);L-2-氯-苯丙氨酸(上海恒創(chuàng)生物科技,批號(hào)：1080094)。

1.3 總流程

圖1所示，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行糖水基線測(cè)定。將大鼠分為刺激大鼠24只、空白大鼠(Control組)6只。然后將刺激大鼠均分為4組：CUMS組、CUMS+1W組、CUMS+2W組和CUMS+3W組。開(kāi)始針刺，1周后CUMS+1W組取材，2周后CUMS+2W組取材，3周后CUMS+3W組和CUMS組取材。

圖1 總流程圖

1.4 動(dòng)物模型

刺激方式包括：減小居住空間、異物、異味、敵人入侵和干擾睡眠等[5]。兩天內(nèi)不重復(fù)使用同種刺激。

1.5 糖水消耗

給予大鼠兩瓶外觀完全一致的純水和糖水。實(shí)驗(yàn)全程為24 h，在中途將兩瓶水交換位置。計(jì)算糖水消耗的比例。

1.6 針刺方法

鼠板固定后對(duì)針具(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司)進(jìn)行酒精消毒清理。本實(shí)驗(yàn)選取百會(huì)(位于頭部正中，兩耳中點(diǎn))和四神聰(百會(huì)旁開(kāi)1寸)，平刺進(jìn)針4～6 mm，20 min后拔針[6]。

1.7 取材方法

水合氯醛(10%)麻醉后取盲腸內(nèi)容物到凍存管中并儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

1.8 GC-MS

選用美國(guó)安捷倫公司GC-MS儀器。具體為[7-8]:30 mg糞便、20 μL L-2-氯-苯丙氨酸溶液與600 μL甲醇加入到離心管中;超低溫冰箱放置后進(jìn)行研磨，超聲進(jìn)行提取后低溫靜置，離心后取上清。質(zhì)控樣品與檢測(cè)樣品采用同樣的處理模式。樣品分析模式：不分流進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)(樣品量：1 μL)。質(zhì)譜進(jìn)樣條件：280℃，6.0 mL/min。連續(xù)隨機(jī)樣本分析模式。離子源和四極桿分別為230℃、150℃。升溫步驟由60℃至310℃。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

1.9.1 行為學(xué) 應(yīng)用SPSS 23.0進(jìn)行糖水消耗數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布情況，采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.01具有顯著性差異。

1.9.2 GC-MS數(shù)據(jù)分析 首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理(ChromaTOF軟件)，將假陽(yáng)性數(shù)據(jù)清除后獲得樣品信息。響應(yīng)強(qiáng)度峰面積歸一化后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件(SIMCA-P+14.0軟件)。整合數(shù)據(jù)后先評(píng)價(jià)樣本總體趨勢(shì)：無(wú)監(jiān)督分析(PCA)。再對(duì)組間差異物質(zhì)進(jìn)行鑒別：有監(jiān)督分析方法((O)PLS-DA)。進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證采用7次交互驗(yàn)證和200次檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 針刺治療對(duì)CUMS大鼠糖水消耗的影響

如圖2所示，第4周刺激大鼠的SPT數(shù)值顯著低于空白大鼠(P<0.01)。在針刺治療的過(guò)程中，大鼠的糖水消耗呈上升趨勢(shì)，直到治療3周后，針刺大鼠糖水消耗恢復(fù)。見(jiàn)表1。

表1 各組糖水消耗值

注：與control組相比，**P<0.01。圖2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

2.2 針刺改變CUMS大鼠糞便代謝水平

如圖3所示，本研究選取針刺治療過(guò)程中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)和CUMS大鼠的糞便。PCA分析不能區(qū)分4組。OPLS-DA尚能將4組區(qū)分。排列驗(yàn)證得出該模型可靠。差異代謝物中23種在CUMS+3W組和CUMS組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且在治療的3周中一直處于升高或降低的變化趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

2.3 關(guān)鍵代謝途徑

針刺過(guò)程中始終保持升高或降低的差異代謝物參與的代謝通路：①甘、蘇和絲氨酸的代謝;②氨酰基的合成;③磷酸肌醇代謝和;④半胱氨酸和蛋氨酸的代謝。代謝通路和影響值如圖4～5。

圖3 代謝平臺(tái)分析

表2 4組糞便差異代謝物

圖4 影響值(impact factor≥0.1)

3 討論

全世界約有15%的人口正遭受著抑郁癥的困擾，而且發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)[9-10]。盡管人們不斷的努力，但抗抑郁藥物帶來(lái)的副作用仍然無(wú)法避免。百會(huì)和四神聰位于頭部，是臨床上治療抑郁癥的常用穴位[11-14]。頭部為人體陽(yáng)經(jīng)交匯之處，稱為“諸陽(yáng)之會(huì)”，通過(guò)針刺頭部穴位能夠起到平衡陰陽(yáng)之效，百會(huì)為督脈之穴，在抑郁癥的治療中起到了不可替代的作用。臨床上還可根據(jù)辨證論治選擇配穴，從而達(dá)到整體治療的目的。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程采用糖水消耗進(jìn)行評(píng)價(jià)，判斷模型是否成功以及針刺治療效果。本研究中針刺提高了CUMS大鼠糖水消耗值，逆轉(zhuǎn)了欣快感缺乏的抑郁樣行為，進(jìn)一步證實(shí)針刺在抑郁癥治療中的作用。

隨著“微生物-腸-腦”軸這一概念的逐步深入，腸道微生物的相關(guān)研究在神經(jīng)精神疾病的領(lǐng)域日益增多[15]。作為與人類共生的微生物，其代謝對(duì)人體的影響不可忽視。本研究選取經(jīng)典模型對(duì)其進(jìn)行針刺治療，取針刺治療1周、2周、3周和CUMS組大鼠盲腸內(nèi)容物，探討代謝的改變及其參與的途徑。23個(gè)差異代謝物在CUMS+3W組和CUMS組之間存在顯著差異，并且在治療過(guò)程中保持始終升高或者降低的趨勢(shì)。參與以下代謝：甘、蘇和絲氨酸的代謝(L-絲氨酸，L-蘇氨酸)，氨酰基合成(L-絲氨酸，L-蛋氨酸，L-蘇氨酸，L-脯氨酸)，半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(L-絲氨酸，L-蛋氨酸)和磷酸肌醇代謝(肌醇)。以上結(jié)果提示針刺治療過(guò)程中主要是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)容物的氨基酸代謝和肌醇代謝發(fā)揮作用。絲氨酸為非必須氨基酸，能夠?qū)χ舅岬拇x起調(diào)節(jié)作用。有研究表明，外源性L-絲氨酸可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大腦絲氨酸代謝相關(guān)的不同機(jī)制而發(fā)揮抗抑郁樣作用[16]。ACTH誘發(fā)的抑郁大鼠模型蘇氨酸異常，可能在抑郁癥的氨基酸代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。在抑郁樣行為發(fā)展過(guò)程的監(jiān)測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)L-蘇氨酸、絲氨酸和氧化脯氨酸等氨基酸在抑郁癥的形成過(guò)程中存在一致的變化[18]。有研究表明，重度抑郁癥患者海馬和前額葉的肌醇水平異常[19]。本研究證實(shí)針刺調(diào)節(jié)CUMS大鼠腸道內(nèi)容物的肌醇水平，提示針刺治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸-腦軸的代謝發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了針刺對(duì)CUMS大鼠的腸道內(nèi)容物代謝具有調(diào)節(jié)作用，找到糞便關(guān)鍵代謝通路。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)所調(diào)節(jié)的代謝物在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中都起到關(guān)鍵的作用，進(jìn)一步說(shuō)明針刺治療的重要性。本課題組正在進(jìn)行同時(shí)間點(diǎn)糞便多樣性的檢測(cè)，預(yù)計(jì)將結(jié)果與本研究結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，補(bǔ)充針刺對(duì)“微生物-腸-腦”軸調(diào)節(jié)的相關(guān)數(shù)據(jù)。