引火湯改善長期OVX小鼠焦慮樣行為的機制研究

伊金月，張悅，邱琦，劉爽，關(guān)雨佳，張寧,，孫慧峰，董曉紅，徐紅丹,*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

絕經(jīng)后焦慮癥(Postmenopausal anxiety，PMA)的神經(jīng)生物學(xué)機制尚不清楚，卵巢功能衰退并停止分泌雌激素是比較明確的直接因素，因而雌激素替代療法是臨床常用的治療方法，但是由于其致癌等副作用，應(yīng)用受到限制[1]。精神藥物雖對本病治療效果尚佳，但因其具有成癮性等風(fēng)險，患者服藥的依從性較差[2]。因此，尋找切實有效并且患者能接受的新藥十分有必要，而中藥具有明顯優(yōu)勢。引火湯出自陳士鐸《辨證錄》， 原方組成：熟地三兩，巴戟天一兩，茯苓五錢，麥冬一兩，北無味二錢，具有“滋陰補腎、引火歸元”之功效[3]。更年期焦慮癥屬“陰虛火旺”型郁證范疇[4]，恰是引火湯適應(yīng)之證候，并且本課題組前期研究顯示，引火湯對更年期綜合征中的諸多癥狀均有改善作用。本研究采用長期雙側(cè)卵巢摘除(Bilateral ovariectomies,OVX)的方法模擬絕經(jīng)后狀態(tài)，觀察引火湯對長期OVX模型小鼠焦慮癥狀的治療作用，及其對體質(zhì)量、子宮系數(shù)、子宮形態(tài)及海馬神經(jīng)元存活數(shù)量等方面的影響，并探討這些指標(biāo)的內(nèi)在聯(lián)系，挖掘引火湯治療絕經(jīng)后焦慮癥的藥效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR品系小鼠，雌性，體質(zhì)量20～25 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實驗中心提供，合格證號：SCXK(黑)2013-0004。

1.2 實驗藥品及試劑

引火湯由熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬及北五味子組成，購于北京同仁堂哈爾濱分公司。補佳樂(戊酸雌二醇片)，生產(chǎn)批號：214A劑，購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司。

1.3 造模、分組及給藥

本研究采用長期雙側(cè)卵巢摘除術(shù)(OVX)聯(lián)合單頻超聲刺激(single-frequency ultrasonic stimulation，SFUS)復(fù)制絕經(jīng)后焦慮癥模型。小鼠在10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后采用背式術(shù)式行雙側(cè)卵巢摘除。假手術(shù)組(Sham組)暴露卵巢后，摘取同樣大小脂肪團代替卵巢。行為學(xué)實驗測試前給予各組小鼠SFUS 6 min，誘發(fā)焦慮狀態(tài)。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(OVX組)、陽性藥組(E2組)和引火湯組(YHT組)，每組10只，分組后開始OVX手術(shù)，OVX術(shù)后第3天開始，連續(xù)5 d經(jīng)陰道涂片觀察OVX手術(shù)是否成功，剔除不合格樣本。于OVX術(shù)后57 d開始連續(xù)灌胃給藥21 d。各組小鼠按0.1 mL/10 g給藥劑量灌胃，Sham組和OVX組小鼠生理鹽水灌胃， E2組小鼠給予戊酸雌二醇(0.013 mg/mL)，YHT組小鼠給予引火湯水煎劑(2.34 g/mL)。第78天進行行為學(xué)測試，行為學(xué)測試結(jié)束后各組小鼠取材。

1.4 引火湯煎劑的制備

熟地黃15 g，巴戟天10 g，麥冬10 g，茯苓5 g，北五味子5 g，共計45 g，加8倍量水浸泡2 h，水煎提取2次，各1 h，將2次所得藥液混合用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2.34 g/mL。

1.5 行為學(xué)實驗

1.5.1 明暗箱(Light and dark box,LDB)

LDB包括明箱、暗箱和明暗箱之間的穿梭洞三部分，明箱(60 cm×30 cm×20 cm)是白色開放箱體，暗箱(60 cm×30 cm×20 cm)是黑色封閉箱體，穿梭洞位于明暗箱中間(5 cm×5 cm)。將受試小鼠置于明箱內(nèi)，立即開始計時，記錄分析5 min內(nèi)小鼠在明箱停留時間和明暗箱穿梭次數(shù)。

1.5.2 高架十字迷宮(Elevetated plus maze,EPM)

將受試小鼠面向開放臂方向放置于中央平臺。測試結(jié)束后用95%酒精清潔EPM設(shè)備，實驗進行時保持環(huán)境安靜。記錄受試小鼠5 min內(nèi)，開臂滯留時間百分比(OAT)和開臂進入次數(shù)百分比(OAE)兩個指標(biāo)。

1.6 石蠟切片HE染色

各組小鼠取子宮后，稱重后固定于4%多聚甲醛中48 h，經(jīng)脫水包埋過程制成蠟塊，各組取樣本切成石蠟片，37 ℃恒溫烘片48 h，開始HE染色?；静襟E：常規(guī)脫蠟，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，淡氨水返藍，伊紅染色，脫水，透明，封片。

1.7 尼氏小體染色

本實驗以尼氏染色法觀察各組小鼠海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)。隨機在各組小鼠中選取5只，心臟灌流后取腦，取腦后固定方法和制片方法同“1.6”，烘片結(jié)束后開始染色，60 ℃1%甲苯胺藍溶液浸染30 min，自來水沖洗，脫水，透明，封片。

1.8 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測定E2水平

各組小鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，迅速斷頭，于冰上取腦，沿中縫矢狀切，將每只半腦稱重并記錄，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。勻漿時，取出標(biāo)本，加9倍PBS充分研磨，離心機預(yù)冷4 ℃，13 000 r/min，離心20 min后小心吸取上清，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測定腦組織內(nèi)E2水平，本實驗ELISA試劑盒采用雙抗夾心法測定E2水平，按照說明書操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理及圖像分析

2 結(jié)果與分析

2.1 引火湯對長期OVX小鼠陰道細(xì)胞的影響

正常小鼠陰道細(xì)胞種類及特點隨著性周期的變化呈現(xiàn)出動情前期、動情期、動情后期和動情間期的周期性變化。陰道涂片結(jié)果顯示，OVX小鼠陰道細(xì)胞周期性變化消失，持續(xù)處于動情間期，特點為大量的白細(xì)胞伴有少量的上皮細(xì)胞，說明OVX手術(shù)成功。Sham組小鼠陰道細(xì)胞則出現(xiàn)典型的周期性變化，如圖1所示，A:完整的上皮細(xì)胞；B:大量角化細(xì)胞且密集成片分布；C:角化細(xì)胞和白細(xì)胞；D:白細(xì)胞伴有少數(shù)有核上皮細(xì)胞。

注：A:動情前期；B:動情期；C:動情后期；D:動情間期。圖1 各期小鼠陰道涂片(HE染色，×400)

2.2 引火湯對長期OVX小鼠在LDB、EPM實驗中各指標(biāo)的影響

LDB、EMP實驗結(jié)果見表1，與Sham組相比，OVX組小鼠明箱停留時間、明暗箱穿梭次數(shù)均顯著減少(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠明箱停留時間、明暗箱穿梭次數(shù)均顯著增加(P<0.01)。與Sham組相比，OVX組小鼠OAT、OAE均顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與OVX組相比，YHT組小鼠OAT、OAE均顯著增加(P<0.01)。

2.3 引火湯對長期OVX小鼠腦內(nèi)E2水平的影響

ELISA實驗結(jié)果見表2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與測得OD值繪制腦內(nèi)E2標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)換算各組小鼠腦內(nèi)E2水平見圖3。與Sham組相比，OVX小鼠腦勻漿后測得腦內(nèi)E2水平顯著降低(P<0.05)，與OVX組小鼠相比，YHT組小鼠腦內(nèi)E2水平顯著升高(P<0.05)，但與E2組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；說明引火湯可上調(diào)長期OVX小鼠腦內(nèi)E2水平。

表2 各組小鼠OD值比較

2.4 引火湯對長期OVX小鼠體質(zhì)量(BW)和子宮重量(UW)的影響

各組體質(zhì)量及子宮重量見圖4，與Sham組相比，OVX組小鼠體質(zhì)量(Body weight，BW)顯著增加(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異。與Sham組相比，OVX組小鼠子宮重量(Uterus weight，UW)顯著減少(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠子宮重量無顯著性差異。

圖2 腦內(nèi)E2標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：與Sham組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。圖3 引火湯對長期OVX小鼠腦內(nèi)E2水平的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。圖4 引火湯對OVX小鼠BW、UW的影響

2.5 引火湯對長期OVX小鼠子宮形態(tài)的影響

各組子宮HE染色結(jié)果見圖5，Sham組小鼠子宮內(nèi)膜連續(xù)完整，子宮壁細(xì)胞形態(tài)正常排列緊密有序，腺體豐富。與Sham組相比，OVX小鼠子宮內(nèi)膜變薄且不完整，子宮壁萎縮，肌層細(xì)胞排列紊亂，可見胞膜破損核固縮，宮腔變窄。與OVX組相比，YHT組小鼠子宮形態(tài)未見明顯改變。

2.6 引火湯對長期OVX小鼠海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響

尼氏染色結(jié)果見圖6，Sham組小鼠海馬齒狀回(DG)神經(jīng)元排列規(guī)律緊密，尼氏體染色均勻豐富，藍色顆粒狀染色神經(jīng)元數(shù)目多且排列有序。與Sham組相比，OVX小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元排列松散，大量神經(jīng)元丟失，尼氏染色顆粒狀神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。與OVX組小鼠相比，YHT組小鼠海馬DG區(qū)顆粒神經(jīng)元排列有序，尼氏體染色均勻豐富，尼氏染色陽性神經(jīng)元數(shù)目多。

注：A:Sham組；B:OVX組；C:E2組；D:YHT組。圖5 各組小鼠子宮橫切面(HE染色，×400)

注：A:Sham組；B:OVX組；C:E2組；D:YHT組。圖6 各組小鼠海馬DG區(qū)(尼氏染色，×100)

3 討論

研究表明，焦慮癥發(fā)病是機體內(nèi)環(huán)境平衡紊亂與外界負(fù)性刺激如長期應(yīng)激共同作用的結(jié)果，目前認(rèn)為，導(dǎo)致其發(fā)病的易感因素有下丘腦垂體腎上腺軸(HPA)亢進、性激素水平下降、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等[5]。學(xué)者普遍認(rèn)為焦慮癥發(fā)病關(guān)鍵部位在海馬，海馬是“海馬-穹窿-乳頭體-丘腦前核-扣帶回-海馬”構(gòu)成的帕帕茲環(huán)(Papez 環(huán)路)中的關(guān)鍵部位，Papez環(huán)路是情感形式、本能相關(guān)的各種情緒等的神經(jīng)解剖基礎(chǔ)[6]。雖然絕經(jīng)后焦慮癥(PMA)的神經(jīng)生物學(xué)機制尚不十分清楚，但流行病學(xué)及諸多實驗研究顯示絕經(jīng)后雌激素斷崖式撤退是引起焦慮癥發(fā)作的最直接因素[7]，因為生理水平的雌激素可通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子，改善神經(jīng)元生長微環(huán)境等方式保護海馬神經(jīng)元抵抗長期慢性應(yīng)激性損傷[5]。因而臨床常用雌激素替代療法(Estrogen replacement therapy,ERT)治療絕經(jīng)后抑郁癥。然而流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于ERT方法可誘發(fā)多種生殖系統(tǒng)癌癥如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌，基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)補充外源性雌激素的致癌風(fēng)險與其是否對雌激素受體有選擇性激活作用有關(guān)[8]。雌激素受體包括膜受體(GPR30)和核受體，核受體有兩種亞型，包括ERα和ERβ兩個亞型[9]。ERα主要在生殖功能相關(guān)器官表達,如乳腺、子宮和陰道等，是雌激素促進第二性征成熟的主要通路，同時也是ERT法誘發(fā)多種生殖系統(tǒng)癌癥的直接通路[10]。ERβ則主要表達在中樞，尤其是在海馬區(qū)高表達，是腦內(nèi)雌激素發(fā)揮腦保護作用的優(yōu)勢通路，ERβ通路參與認(rèn)知、記憶及情緒調(diào)節(jié)功能[11-12]。因此，一般認(rèn)為能上調(diào)體內(nèi)雌激素水平或發(fā)揮類雌激素作用，并對ERβ通路有選擇性激活作用的藥物是治療PMA的理想藥物。

本課題組前期已經(jīng)對“腎通于腦”理論的生物學(xué)實質(zhì)進行了探討，證實補腎中藥可以上調(diào)體內(nèi)雌激素水平或者通過類雌激素作用而發(fā)揮腦保護作用[13]，同時中藥復(fù)方具有多因素多靶點的特點，能夠針對疾病多個病理環(huán)節(jié)進行對因治療，相比于單一因素的治療有明顯的優(yōu)勢。引火湯由“熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬、北五味”組成，具有“滋陰補腎、引火歸元”之功效，對陰虛火旺型更年期躁癥有改善作用。課題組前期已經(jīng)證實引火湯可改善女性更年期綜合征小鼠的諸多癥狀，并且可上調(diào)血清雌二醇(E2)水平[14]。本實驗結(jié)果顯示，引火湯可以顯著改善PMA模型小鼠的焦慮癥狀，筆者同時發(fā)現(xiàn)引火湯與雌二醇對PMA模型小鼠的治療效果無顯著性差異?；谝饻乃幮C理及前期研究結(jié)果，筆者推測引火湯有可能同樣以增強體內(nèi)雌激素效應(yīng)為基礎(chǔ)發(fā)揮抗PMA作用，然而對PMA而言，雌激素作用的靶器官在大腦。本實驗繼續(xù)檢測各組小鼠的腦內(nèi)E2水平，實驗結(jié)果顯示，引火湯能上調(diào)長期OVX小鼠腦內(nèi)E2水平，可見引火湯可通過補腎作用，上調(diào)血清及腦內(nèi)E2水平。因此，在“益腎通腦”理論指導(dǎo)下，筆者推測引火湯治療PMA的機制之一是上調(diào)PMA模型小鼠腦內(nèi)E2水平。本研究結(jié)果還顯示，雌二醇在改善海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和功能的同時對長期OVX小鼠的體質(zhì)量、子宮重量和子宮形態(tài)均有顯著改善作用，以ERα和ERβ在體內(nèi)表達位置為基礎(chǔ)推測，外源性雌激素對以ERα和ERβ這兩種核受體并沒有選擇性激活作用，這是其引起致癌等副反應(yīng)的主要機制。但是引火湯治療PMA同時，卻對長期OVX小鼠體質(zhì)量和子宮重量無顯著性改變，對長期OVX小鼠的子宮形態(tài)無明顯改變，而子宮重量及形態(tài)的維持均與ERα通路激活有關(guān)，然而尼氏染色結(jié)果顯示，引火湯對中樞與E2有相似地保護作用，對海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和功能有明顯改善作用。因此筆者推測，引火湯在上調(diào)長期OVX小鼠腦內(nèi)E2水平的同時對ERα和ERβ這兩種核受體有選擇性激活作用。

4 結(jié)論

結(jié)合課題組前期研究，本實驗結(jié)果提示引火湯治療絕經(jīng)后焦慮癥的機制可能是通過補腎作用上調(diào)血清及腦內(nèi)雌激素水平，并對腦內(nèi)雌激素核受體有選擇性，即對ERβ有選擇性激活作用而對ERα作用不明顯。因此，與雌激素替代療法相比，引火湯在治療絕經(jīng)后焦慮癥的同時可能會降低致癌等風(fēng)險，筆者將繼續(xù)對引火湯治療PMA的神經(jīng)生物學(xué)機制進行深入研究，為研發(fā)安全有效的抗絕經(jīng)后焦慮癥的新藥提供新思路。