低鹽保溫發(fā)酵對毛霉型豆豉品質(zhì)的影響

梁 如，朱新鵬，李宏梁，黃 軒，崔榮榮，蘇丹敏

（1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2.安康市富硒食品技術(shù)研發(fā)中心，陜西 安康 725000；3．陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

1 前言

豆豉是以黃豆或黑豆為原料，經(jīng)微生物作用而制成的一種具有特殊風(fēng)味的調(diào)味品，并有悠久的制作和食用歷史。豆豉釀造主要包括制曲和后發(fā)酵兩個階段，依據(jù)制曲中優(yōu)勢微生物種類，可分為米曲霉型、毛霉型、根霉型和細(xì)菌型[1]。豆豉不僅富含糖、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含豆豉纖溶酶、類黑精和大豆異黃酮等多種生理活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對預(yù)防疾病、降血壓和抗自由基等有重要作用[2-6]。

食鹽作為豆豉后發(fā)酵中的重要物質(zhì)，用以抑制微生物過度繁殖，保證豆豉優(yōu)良風(fēng)味，但也使得成品豆豉中鹽分含量過高，達(dá)10%～15%[7]。越來越多研究表明，高食鹽攝入與高血壓、心臟病和肝臟功能損傷有關(guān)，因此，低鹽化發(fā)酵是我國傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品釀造的一個發(fā)展趨勢和必然要求[8]。目前，關(guān)于低鹽豆豉發(fā)酵的方法主要有以其他氯化物（KCl、MgCl2、MnCl2）和氨酸鹽替代食鹽進(jìn)行減鹽發(fā)酵、以香辛料替代部分食鹽進(jìn)行減鹽發(fā)酵[9]。同時還可以采用微生物強(qiáng)化發(fā)酵[10]和提高發(fā)酵溫度來抑制雜菌繁殖[11]。

發(fā)酵溫度是影響豆豉和醬油等發(fā)酵食品后熟和品質(zhì)的重要因素，目前，豆豉和醬油的生產(chǎn)過程中主要依賴環(huán)境溫度[12]，在以小作坊式生產(chǎn)的企業(yè)中更是如此。隨著傳統(tǒng)食品釀造企業(yè)機(jī)械化和規(guī)?；l(fā)展，溫度控制和調(diào)控相對來說越來越容易。本研究結(jié)合已有的研究結(jié)果[13-14]，研究保溫（40℃）、低鹽（9%）發(fā)酵條件對毛霉型豆豉的理化指標(biāo)、游離氨基酸、蛋白酶活力和揮發(fā)性組分的影響，并與自然發(fā)酵豆豉樣品品質(zhì)進(jìn)行比較，以期為豆豉釀造機(jī)械化和規(guī)?；a(chǎn)提供一定的理論支撐。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 菌種：毛霉（Actinomucor elegans）。分離自成熟良好的豆豉曲，運(yùn)用形態(tài)學(xué)、生理生化和26S rDNA和ITS方法鑒定，并以斜面培養(yǎng)物方式低溫保藏，每4個月轉(zhuǎn)接一次。

2.1.2 培養(yǎng)基：毛霉試管斜面培養(yǎng)基。選取麥芽汁培養(yǎng)基，用于制作斜面培養(yǎng)基和菌株的保存。毛霉種曲培養(yǎng)基和種曲制作方法參考何桂強(qiáng)等[15]描述的方法。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 工藝過程

參考張宇昊等[16]的豆豉生產(chǎn)工藝流程，如圖1所示。具體方法為：（1）取自制成熟毛霉豆豉曲5kg，拌入9%鹽分置于40℃條件下保溫發(fā)酵的豆豉作為低鹽發(fā)酵組，記為9#樣品；（2）將按照傳統(tǒng)工藝拌入13%鹽分置于40℃條件下保溫發(fā)酵的豆豉作為對照發(fā)酵組，記為13#樣品；（3）將按照傳統(tǒng)工藝拌入13%鹽分置于自然溫度發(fā)酵的豆豉記為13#-T。每個處理做三個平行，分別取三個平行樣品，混合均勻后，置于-18℃保存，用于指標(biāo)測定。

圖1 豆豉生產(chǎn)工藝流程

2.2.2 蛋白酶活力測定

采用福林酚法測定豆豉后發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化，具體方法參照GB/T 23527—2009進(jìn)行。

2.2.3 理化指標(biāo)測定

總酸（TA）、氨基態(tài)氮（AN）、還原糖（RS）測定：采用滴定法測定樣品中TA（以乳酸計）、AN 的含量[17]、RS 的含量[18]。

2.2.4 游離氨基酸（FAA）測定

參考崔瑞迎等[19]所述方法，用氨基酸自動分析儀檢測豆豉樣品中FAA。具體方法如下：精確稱取樣品5.00g，加入蒸餾水研磨后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容至50mL，取10mL濾液，加5mL 10%三氯乙酸溶液，室溫靜置提取2h，離心（10000×g，4℃）10min，上清液經(jīng)0.45mm濾膜過濾并適當(dāng)稀釋后，用自動氨基酸檢測儀（A300，membracePure GmbH，德國）檢測FAA的含量。

2.2.5 揮發(fā)性組分測定

參考何桂強(qiáng)等[15]描述的方法，用頂空固相萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）檢測豆豉樣品中揮發(fā)性組分。操作步驟：精確稱取2.00g豆豉樣品于頂空瓶中，加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇（99mg/L）和辛酸甲酯（23mg/L，Sigma-aldrich，St.louis，MO，USA）各10μ m，60℃條件下平衡15min，插入固相微萃取頭（CAR/PDMS/DVB，50/30μm，Supelco，USA），萃取45min。在GC進(jìn)樣口中解吸3min，檢測其揮發(fā)性組分。色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×0.32mm×0.25μm，Agilent，USA）；升溫程序：40℃保持5 min，然后以4℃/min升至100℃，再以6℃/min升至230℃，保持10min，進(jìn)樣口溫度250℃；以高純氦氣為載氣，流速1.0mL/min；離子源溫度和連接線溫度分別為230℃和250℃；EI電子能量為70eV；質(zhì)量掃描范圍為35～400amu。通過待測樣品組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST2005）比對，匹配度大于800（最大為1000）的物質(zhì)予以報道，采用內(nèi)標(biāo)法對樣品中各檢出物質(zhì)進(jìn)行半定量計算。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽分對保溫發(fā)酵過程中蛋白酶活力的影響

圖2為蛋白酶活力在保溫發(fā)酵過程中的變化趨勢。由圖2可知，發(fā)酵過程中蛋白酶活力呈現(xiàn)持續(xù)降低的變化趨勢，且低鹽樣品的降速低于高鹽樣品，說明鹽分抑制了酶的活性。這與周濤等[9]研究的結(jié)果一致。豆豉后發(fā)酵過程中蛋白酶水解蛋白質(zhì)形成短肽，賦予了豆豉降血壓、抗氧化等多種保健功能，同時多肽進(jìn)一步水解為游離氨基酸，由此可推測低鹽發(fā)酵豆豉樣品9#的氨基態(tài)氮和游離氨基酸含量均高于13#樣品。

圖2 保溫發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化

3.2 鹽分對保溫發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的影響

下頁圖3a、3b、3c分別為保溫發(fā)酵過程中還原糖（RS）、氨基態(tài)氮（AN）和總酸（TA）的變化趨勢。圖3顯示，整個發(fā)酵過程中，RS、AN和TA在9#樣品中的含量均高于在13#樣品中的含量。豆豉樣品中還原糖的變化受淀粉酶水解淀粉形成葡萄糖等單糖速率與微生物消耗葡萄糖等單糖速率的影響，圖3a顯示，在發(fā)酵前期10天，生成速率高于消耗速率，因此RS含量增加，而隨發(fā)酵時間進(jìn)行，淀粉酶活力受鹽影響降低，還原糖生成速率降低，而由于微生物生長，消耗速率增加，因此表現(xiàn)為還原糖含量降低。豆豉中微生物代謝糖類等物質(zhì)形成乳酸和乙酸等有機(jī)酸，低鹽條件下微生物生長受鹽分影響較小，因此，9#樣品中總酸含量高于13#樣品總酸含量，這也與發(fā)酵后期RS快速降低的變化趨勢相一致。圖3b顯示，9#樣品中AN的含量高于13#樣品中AN的含量，與其對應(yīng)樣品中蛋白酶活力的變化趨勢一致。

圖3 保溫發(fā)酵過程中RS（a）、AN（b）和TA（c）的變化

3.3 低鹽發(fā)酵對游離氨基酸的影響

游離氨基酸（FAA）既是風(fēng)味物質(zhì)，又是風(fēng)味前體物物質(zhì)，對豆豉特征風(fēng)味的形成具有重要作用[20]。因此，考察和檢測游離氨基酸含量的變化對豆豉發(fā)酵工藝改進(jìn)和提升產(chǎn)品質(zhì)量有重要意義。下頁表1為三種類型豆豉樣品中FAAs的組成和含量，共檢出了18種FAAs，其中人體必需的氨基酸7種。9#樣品中FAAs總含量最高，其次為保溫發(fā)酵的13#樣品，而13#-T樣品中含量最低，此結(jié)果與蛋白酶活力和氨基的辯護(hù)一致，這是由于升高溫度加快了酶促反應(yīng)速率，使得相同時間內(nèi)游離氨基酸生成量增加，同時，由于9#樣品中鹽分低，酶失活速率減?。ㄒ妶D2），進(jìn)一步增加了FAA生成，因此，在低鹽保溫發(fā)酵豆豉樣品中FAA總含量最高。色氨酸僅在保溫發(fā)酵的兩個豆豉樣品中檢出，而天門冬酰胺僅在常溫發(fā)酵的13#-T樣品中檢出。其余各種FAA在各樣品中的含量與總FAA的含量變化差異一致。優(yōu)勢氨基酸為谷氨酸，這是一種重要的鮮味氨基酸，與NaCl協(xié)同作用時，降低鮮味閾值，使產(chǎn)品鮮味更濃郁[21-22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低鹽保溫發(fā)酵促進(jìn)了蛋白質(zhì)水解，提升了豆豉產(chǎn)品的鮮味。

3.4 低鹽保溫發(fā)酵對揮發(fā)性組分的影響

采用HS-SPME-GC-MS對三類樣品中揮發(fā)性組分分析，三類樣品中共檢出醇類（6），酸類（3），酯類 （22），雜環(huán)類 （10），烴類 （6），醛類（6），酚類（7）和其他類（3）共八類64種揮發(fā)性組分。其中，酯類組分?jǐn)?shù)量最多，共22種，含量占檢出揮發(fā)性組分總含量的22%～35%（見圖4）。各樣品中檢出的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量有差異，9#、13#和13#-T樣品分別檢出了62種、63種和55種揮發(fā)性組分。揮發(fā)性組分總含量表現(xiàn)為：保溫發(fā)酵樣品高于自然發(fā)酵樣品，低鹽保溫發(fā)酵9#樣品略高于13#樣品（見下頁圖5）。由圖4還可以知道，酸類組分、酯類組分和醛類組分為優(yōu)勢揮發(fā)性組分，占檢出揮發(fā)性組分總含量的74%～88%。其中酯類組分在9#樣品中占比最大，為35%，酸類組分在13#樣品中占比最大，為43%，而醛類組分在13#-T樣品中占比最大，為38%。由此可知，發(fā)酵溫度和鹽分對揮發(fā)性組分的形成具有重要影響。

圖4 不同樣品中各類揮發(fā)性組分所占百分比

表1 不同樣品中游離氨基酸含量比較

圖5 不同樣品中揮發(fā)性組分總含量

酯類組分主要由酵母菌代謝或醇和酸酯化產(chǎn)生[23]。短鏈脂肪酸酯，如辛酸乙酯、己酸乙酯和庚酸乙酯，能賦予其水果的芳香，且對緩解胺類和脂肪酸的刺激性和苦味有重要貢獻(xiàn)[24-25]。對下頁表2中的9#與13#樣品中揮發(fā)性組分的含量進(jìn)行比較可知，低鹽保溫發(fā)酵有利于對產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)大的酯類組分積累，其中，酯類組分中對酯類組分含量貢獻(xiàn)大的辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯的含量表現(xiàn)為：9#樣品高于13#樣品。另外，苯甲酸乙酯、月桂酸甲酯、棕櫚酸甲酯和9-十六碳烯酸乙酯的含量表現(xiàn)為：9#樣品均高于13#樣品。對13#與13#-T樣品中的揮發(fā)性組分含量進(jìn)行比較可知，保溫發(fā)酵使豆豉樣品中酯類組分?jǐn)?shù)量增加，與13#-T相比，13#樣品中檢出的酯類組分增加了6種，分別是己酸乙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸異戊酯、己酸己酯、乙酸-2-苯基乙酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻酸乙酯。對于優(yōu)勢酯類組分辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯而言，辛酸乙酯在13#樣品中的含量是13#-T樣品含量的5.9倍，而棕櫚酸乙酯含量表現(xiàn)為：13#-T樣品高于13#樣品。其次，油酸乙酯和亞油酸乙酯則在三個樣品中的含量差異不大。

三個樣品中檢出的酸類組分總含量表現(xiàn)為：低鹽樣品9#低于高鹽樣品13#，且13#-T樣品中含量最低，同時數(shù)量最少。但由于酸類物質(zhì)的閾值較高，所以對產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。酸類組分中，乙酸為優(yōu)勢酸類組分，乙酸主要源于微生物的代謝[26]。

表2 不同樣品中揮發(fā)性組分含量比較

續(xù)表

醛類揮發(fā)性組分主要是通過氨基酸降解[27]、脂質(zhì)氧化[28]、脂肪酸氧化以和脫羧[29]以及微生物代謝的產(chǎn)物途徑形成[27]。醛類組分含量約占揮發(fā)組分總含量的19%～38%。大部分醛類揮發(fā)性物質(zhì)的風(fēng)味閾值相對較低，因而醛類揮發(fā)性物質(zhì)對豆豉風(fēng)味的貢獻(xiàn)相對較大。大多數(shù)的醛類物質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)的香氣，如油脂味、甜香味、青草味、花香味及香草味等[30]，優(yōu)勢組分包括苯甲醛、苯乙醛和可卡醛。其中，苯甲醛在兩個保溫樣品中含量相當(dāng)，且都高于自然發(fā)酵樣品13#-T，而苯乙醛和可卡醛含量則表現(xiàn)為：兩個保溫樣品低于自然發(fā)酵樣品13#-T。

雜環(huán)類揮發(fā)性組分和酚類組分在豆豉樣品中含量也比較高（見表2和圖4），且這兩類揮發(fā)性組分在13#-T中的含量高于在9#和13#中的含量。其中，優(yōu)勢組分為2-乙酰吡咯、3-苯基呋喃和2-硝基苯酚，且它們在13#-T中的含量高于在9#和13#中的含量。2-乙酰吡咯是一種具有爆米花香氣的物質(zhì)，是脯氨酸和單糖經(jīng)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[31]，其在13#-T樣品中的含量遠(yuǎn)高于在9#和13#樣品中的含量，13#-T中的含量約是13#含量的5倍，是9#含量的5.8倍。

烴類物質(zhì)是由脂肪酸在酶或非酶氧化作用下形成的一類化合物，由于烴類化合物的風(fēng)味閾值較高[32]，且在樣品中含量較低（見表2），因此檢出的烴類組分對風(fēng)味沒有實(shí)際貢獻(xiàn)，這里不做討論。

對于醇類組分而言，3-甲基丁醇，3-甲硫基-1-丙醇在9#樣品中的含量要高于在13#和13#-T樣品中的含量。醇類組分主要通過羧基還原和不飽和脂肪酸降解等途徑形成[27-29,33]。在40℃條件下發(fā)酵，酵母菌等微生物難以生長。本實(shí)驗(yàn)過程中，對自然發(fā)酵豆豉而言，由于溫度低和發(fā)酵時間短，故樣品中醇類組分含量也比較低。9#樣品由于鹽分低，對酵母菌抑制性弱，相對而言，其醇類組分含量高于13#樣品。同時，由于醇類組分的風(fēng)味閾值也較高，含量較低（見表2），對豆豉風(fēng)味影響不大。

檢出的其他類組分總含量表現(xiàn)為：保溫發(fā)酵產(chǎn)品要明顯高于自然發(fā)酵樣品，其中以2-甲基-3-甲氧基-4-吡喃酮含量變化最為明顯。

綜上所述，對不同發(fā)酵方式豆豉樣品中揮發(fā)性組分比較可知，酯類和醛類組分對豆豉風(fēng)味組分影響較大，低鹽保溫發(fā)酵提高了酯類組分的含量，特別是具有水果香味的辛酸乙酯，在低鹽保溫發(fā)酵樣品中的含量遠(yuǎn)高于其余兩個樣品（見表2）。而醛類組分的含量則表現(xiàn)為：保溫發(fā)酵樣品低于自然發(fā)酵樣品。其中苯乙醛和可卡醛含量在保溫和非保溫樣品中差異最為顯著。

4 結(jié)論

本文以毛霉型豆豉為研究對象，通過比較低鹽保溫發(fā)酵條件下豆豉的理化指標(biāo)、蛋白酶活力、游離氨基酸和揮發(fā)性組分的差異，研究了低鹽保溫發(fā)酵對毛霉豆豉品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示：鹽分影響了蛋白酶活力，從而影響最終產(chǎn)品中氨基態(tài)氮和游離氨基酸的含量，低鹽保溫發(fā)酵增加了豆豉樣品中總酸、氨基態(tài)氮和游離氨基酸的含量；適當(dāng)降低鹽分，提高發(fā)酵溫度，能促進(jìn)豆豉樣品中揮發(fā)性組分積累，特別是酯類組分積累，說明低鹽保溫發(fā)酵方式用于豆豉發(fā)酵是可行的。此外，保溫發(fā)酵使豆豉樣品的醇類揮發(fā)性組分降低而使酸類揮發(fā)性組分升高，這可能是高溫發(fā)酵影響了豆豉后發(fā)酵過程中微生物的演替和變化，其具體原因尚需要進(jìn)一步研究，以期為指導(dǎo)豆豉工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)提供更多的理論支撐。