基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探索黃酮類化合物治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的作用機(jī)制

曲一帆，徐鳳英，王玉珍，謝基明

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010060；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

2019年12月，我國(guó)武漢地區(qū)爆發(fā)了不明原因冠狀病毒肺炎，之后陸續(xù)全國(guó)各地乃至全球均有爆發(fā)此類疫情現(xiàn)象[1]。通過對(duì)肺炎患者分離到的病毒測(cè)序分析顯示是一種新型冠狀病毒。世界衛(wèi)生組織正式將這次新型冠狀病毒肺炎命名為“COVID-19”，國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)則將“新型冠狀病毒”命名為“Severe Acute Respiratory Syndrome-Corona Virus-2”,簡(jiǎn)稱“SARS-CoV-2”[2]。SARS-CoV-2主要經(jīng)呼吸道和密切接觸傳播，具有傳染能力強(qiáng)、人群普遍易感的特點(diǎn)，病毒主要通過人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(ACE2)受體促進(jìn)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。COVID-19患者早期以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可快速發(fā)展為多器官功能衰竭，甚至死亡[3]。在我國(guó)COVID-19被確定為乙類傳染病，并按照甲類傳染病管理辦法進(jìn)行管控?，F(xiàn)西醫(yī)尚無針對(duì)COVID-19的特效藥物，目前臨床以對(duì)癥治療為主，治療炎癥風(fēng)暴的藥物多考慮皮質(zhì)激素，而化學(xué)藥的使用在后期會(huì)出現(xiàn)一系列的不良反應(yīng)[4]。

黃酮類化合物(Flavonoids)是一類普遍分布在各種食源性植物及藥用性植物當(dāng)中，具有2-苯基色原酮母核結(jié)構(gòu)的一種天然化合物。其具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、抗骨質(zhì)疏松等多種生物功能，且副作用小，生物活性高，因此備受研究者們的關(guān)注[5]?；趪?guó)家中醫(yī)藥管理局《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)中醫(yī)方案部分》文件，并從現(xiàn)有的中草藥資源總結(jié)發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方中具有治療COVID-19的活性化合物有較多為黃酮類化合物。因此探究黃酮類化合物治療COVID-19的分子機(jī)制具有明確的現(xiàn)實(shí)意義，以期為黃酮類化合物進(jìn)一步研究提供有力參考[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接是一種以系統(tǒng)生物學(xué)和分子藥理學(xué)為基礎(chǔ)，借助計(jì)算機(jī)生物信息大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)化合物、疾病、病原體進(jìn)行多靶點(diǎn)、多層次、多途徑的系統(tǒng)分析，從而達(dá)到獲取疾病及生理過程數(shù)據(jù)的技術(shù)[7]。由于中醫(yī)藥復(fù)方中的多成分與對(duì)目的疾病多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，系統(tǒng)地闡明其中化合物的生物過程十分困難。選用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接分析化合物作用效果是一種十分貼切的技術(shù)手段，它能夠?qū)⒒衔飳?duì)于病原體的作用過程可視化、系統(tǒng)化、信息化的展現(xiàn)出來，為中藥新藥開發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)，也為臨床應(yīng)用提供理論支持[8]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接手段，探尋常見的黃酮類化合物作用于COVID-19的靶點(diǎn)網(wǎng)信息，系統(tǒng)闡述其治療疾病的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1黃酮類化合物基本藥物參數(shù)與靶點(diǎn)的收集 通過CNKI、PubMed查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9]及有關(guān)臨床報(bào)道[10]，收集現(xiàn)有抗擊COVID-19中藥復(fù)方中及單體的常見黃酮類化合物及其衍生物共計(jì)18個(gè)，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)獲取其基本藥理數(shù)據(jù)。口服生物利用度(OB)是指化合物在給藥后，吸收進(jìn)入血液系統(tǒng)并且機(jī)體可以吸收利用的相對(duì)量，類藥性(DL)則多用于評(píng)估化合物可能成為藥物的可能性，二者數(shù)字越大，越能代表該化合物對(duì)人體有研究?jī)r(jià)值，因此根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)特點(diǎn)，以O(shè)B≥30 %和DL ≥ 0.18為活性成分的篩選閾值，篩選出符合條件的活性成分。并在數(shù)據(jù)庫中篩出每一個(gè)化合物作用的靶點(diǎn)(Relate Tagret)信息，并保存其數(shù)據(jù)詳細(xì)信息。

1.2化合物-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用1.1中獲取的靶點(diǎn)信息，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范得到的靶點(diǎn)名稱，將規(guī)范后的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入perl計(jì)算機(jī)程序語言，得到符合Cytoscape3.7.2軟件識(shí)別的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)文件。在Java1.8環(huán)境下，利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建黃酮類化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3疾病靶點(diǎn)提取及化合物-疾病共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以novel coronavirus為關(guān)鍵詞鍵入搜索，下載關(guān)于COVID-19疾病的靶點(diǎn)信息，利用R語言程序得到化合物與疾病的共同靶點(diǎn)。導(dǎo)出共同靶點(diǎn)文件，使用R語言做出Venn圖，使用Cytoscape3.7.2軟件做出化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和頻次圖 PPI(protein-protein interaction)即蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系，從編碼蛋白質(zhì)的基因間的相互作用可推斷出蛋白質(zhì)間的相互作用[11]。使用1.3中共同靶點(diǎn)文件，將文件內(nèi)容導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，刪除無作用靶點(diǎn)，可得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用R語言程序可計(jì)算得出相互作用頻次，并繪制頻次圖展示相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5GO基因富集分析 GO(Gene Ontology)富集分析可以了解目的基因群富集在哪些生物功能(Biological Process,GO-BP)、細(xì)胞定位(Cellular Component,GO-CC)、分子過程(Molecular Function,GO-MF)三個(gè)方面[12]。使用1.3中共同靶點(diǎn)文件，將文件內(nèi)容導(dǎo)入至Metascape數(shù)據(jù)庫，選擇物種為H.sapiens，提交數(shù)據(jù)，P值定義為0.01，繼續(xù)進(jìn)行個(gè)性化分析并下載得到數(shù)據(jù)。

1.6KEGG信號(hào)通路富集分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集分析可以將目的靶點(diǎn)群的通路功能富集歸類，得到可視化通路數(shù)據(jù)[13]。將1.3中的共同靶點(diǎn)文件，在R語言程序中利用Bioconductor編程代碼，運(yùn)算得出KEGG數(shù)據(jù)圖。

1.7化合物-疾病靶點(diǎn)分子對(duì)接 使用ChemBioDraw14.0和ChemBio3D14.0軟件構(gòu)建黃酮類化合物3D模型。從RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫中下載SARS-CoV-2最有關(guān)靶點(diǎn)ACE2[14](PDBID：1R42)的立體分子結(jié)構(gòu)及其配體文件。運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)ACE2進(jìn)行去水、加氫等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將靶點(diǎn)蛋白配體選定，設(shè)置去除配體后的Grid Box坐標(biāo)，最后運(yùn)行PyMOL軟件進(jìn)行對(duì)接。結(jié)合能小于0說明配體位置與化合物可以自發(fā)結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1黃酮類化合物基本藥物參數(shù)與靶點(diǎn)收集結(jié)果 通過查閱文獻(xiàn)及相關(guān)臨床報(bào)道，借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30 %和DL≥0.18為活性成分的篩選閾值，發(fā)現(xiàn)所選的18個(gè)黃酮類類化合物均符合設(shè)定條件，相關(guān)藥物參數(shù)及靶點(diǎn)數(shù)見表1。

表1 黃酮類化合物基本藥物參數(shù)及作用靶點(diǎn)個(gè)數(shù)

2.2化合物-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)繪制結(jié)果 將TCMSP數(shù)據(jù)庫中查閱到的化合物相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)出以后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范得到的靶點(diǎn)名稱，利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建黃酮類化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1。結(jié)果顯示共計(jì)282個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中黃酮類化合物共有18個(gè)節(jié)點(diǎn))，594條邊。其中槲皮素、山奈酚、木犀草素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯表現(xiàn)出較多的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)能力。

2.3疾病靶點(diǎn)提取結(jié)果及化合物-疾病共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果分析 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以novel coronavirus為關(guān)鍵詞鍵入搜索后，共得到相關(guān)疾病靶點(diǎn)350個(gè)，根據(jù)R語言運(yùn)行結(jié)果，黃酮類化合物與疾病的共同靶點(diǎn)55個(gè)，并依次繪制Venn圖，如圖2。根據(jù)Cytoscape3.7.2運(yùn)行結(jié)果得出共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中黃酮類化合物共有18個(gè)節(jié)點(diǎn)，疾病1個(gè)節(jié)點(diǎn))，227條邊，如圖3。

2.4化合物-疾病共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及結(jié)果分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，刪除無作用靶點(diǎn)，可得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用R語言程序可計(jì)算得出相互作用頻次，并繪制頻次圖展示相關(guān)靶點(diǎn)。其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，節(jié)點(diǎn)內(nèi)圖示為靶蛋白三維構(gòu)象，蛋白與蛋白之間線條表示靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。結(jié)果如圖4顯示，共有節(jié)點(diǎn)55個(gè)，邊722條，數(shù)據(jù)并得出靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值26.3，聚類系數(shù)0,743，P<0.001。對(duì)互做數(shù)排名前30的靶點(diǎn)做頻次圖，如圖5。結(jié)果顯示，IL6、MAPK8、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL4、PTGS2、IFNG等靶蛋白可能是黃酮類化合物防治COVID-19潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5GO基因富集結(jié)果分析 根據(jù)Metascape數(shù)據(jù)庫，選擇物種為H.sapiens，提交數(shù)據(jù)后顯示的結(jié)果，在P值定義為0.01，個(gè)性化分析計(jì)算下得到數(shù)據(jù)，整理得到GO三個(gè)組分的圖表，如圖6?？v坐標(biāo)為Metascape數(shù)據(jù)庫GO編碼及相關(guān)GO靶點(diǎn)名，橫坐標(biāo)為-log(10)P。由上至下為前20條GO-BP、17條GO-MF以及9條GO-CC。相關(guān)性越大則顏色越深。

2.6KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果分析 根據(jù)R語言程序中利用Bioconductor編程代碼，以P<0.05為閾值，運(yùn)算得出的KEGG數(shù)據(jù)圖，如圖7。共富集通路155條，取基因參與最多的前20條做圖，橫坐標(biāo)代表靶點(diǎn)參與通路個(gè)數(shù)，其中多條與呼吸道感染或病毒感染反應(yīng)有關(guān)，其中包括IL-17 signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、 Influenza A、Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Measles。依據(jù)結(jié)果繪制高級(jí)氣泡圖，縱坐標(biāo)為信號(hào)通路，橫坐標(biāo)為通路靶點(diǎn)占總靶點(diǎn)比值，氣泡大小代表個(gè)數(shù)，氣泡顏色代表P值，以-log(10)P表示，如圖8。

2.7黃酮類化合物與ACE2分子對(duì)接結(jié)果分析 通常認(rèn)為受體與配體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，能量越低，越容易結(jié)合產(chǎn)生作用[15]。在Auto Dock1.5.6中選定ACE2的配體，并將18種黃酮類化合物一一與配體對(duì)接并利用腳本計(jì)算結(jié)合能。一般情況下結(jié)合能小于0則可以自發(fā)對(duì)接，選定結(jié)合能<-5KJ/mol為閾值標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示18種黃酮類化合物與ACE2的結(jié)合能均小于0，說明黃酮類化合物與ACE2具有非常好的結(jié)合活性。小于-5KJ/mol的黃酮類化合物有13種，其中木犀草素、異鼠李素、黃芩素、橙皮素、兒茶素等與《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》推薦用藥和國(guó)外一線抗病毒藥[16]相比具有十分優(yōu)異的結(jié)合力。結(jié)合能結(jié)果見表2，部分化合物分子對(duì)接模式見圖9。

表2 黃酮類化合物與部分抗病毒藥物ACE2結(jié)合能

3 討論

COVID-19是在2019年底爆發(fā)的，以SARS-CoV-2為病原體，通過人體ACE2感染細(xì)胞、累及各種器官的一種急性呼吸道傳染病。以乏力、干咳、呼吸困難及發(fā)熱為主要臨床表現(xiàn)，其流行病學(xué)特征和致病機(jī)理尚不完全明確，迄今也未有特效藥物，其治療方案也在不斷更替[17]。有數(shù)據(jù)表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COVID-19效果良好，重點(diǎn)疫區(qū)湖北相關(guān)醫(yī)院的中醫(yī)藥參與救治比例超過三分之二，此次疫情配合中藥復(fù)方或單體參與救治已成為成熟方案[18]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)可在基于傳統(tǒng)功效及臨床定位的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地分析中藥復(fù)方或者單味中藥其中的化合物作用機(jī)制，揭示中藥藥效價(jià)值，本研究通過對(duì)診療方案高頻藥味及其中有效的黃酮類化合物進(jìn)行拆分分析，將病原體所嗜的ACE2進(jìn)行對(duì)接，預(yù)測(cè)黃酮類化合物對(duì)COVID-19的治療價(jià)值，為臨床合理用藥提供有力依據(jù)。

經(jīng)過篩選，共有18種黃酮類化合物，作用于各類疾病靶點(diǎn)264個(gè)，一個(gè)化合物可對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)不同化合物，充分體現(xiàn)了黃酮類化合物多成分、多靶點(diǎn)的特性，也充分顯示出黃酮類化合物家族強(qiáng)大的疾病調(diào)控能力。其中可作用于COVID-19的靶點(diǎn)55個(gè)，從PPI網(wǎng)絡(luò)圖可以推測(cè)黃酮類化合物可通過調(diào)控720余種蛋白途徑參與疾病的轉(zhuǎn)歸。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物主要對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、趨化因子、磷酸化和線粒體凋亡等生物學(xué)過程起調(diào)節(jié)作用。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物主要通過調(diào)控病毒炎癥通路及呼吸道感染通路，例如IL-17 signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、 Influenza A、Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Measles、Tuberculosis。說明黃酮類化合物可以通過抑制這類通路的炎性因子活化、緩解機(jī)體的細(xì)胞因子風(fēng)暴達(dá)到對(duì)抗疾病的目的。最新研究提出理論，新型冠狀病毒感染人體的關(guān)鍵在于SARS-CoV-2表面的S蛋白與人體ACE2蛋白的結(jié)合，即病毒通過其表面S蛋白與ACE2結(jié)合從而侵入人體，破壞其與ACE2的結(jié)合，病毒則無法侵入人體[19]。經(jīng)過分子對(duì)接及結(jié)合能計(jì)算得出黃酮類化合物與ACE2結(jié)合能小，分子對(duì)接效果十分優(yōu)秀，其中異鼠李素、黃芩素可能作為抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，其作用機(jī)制可能是通過影響新型冠狀病毒S蛋白受體結(jié)構(gòu)域與ACE2蛋白結(jié)構(gòu)域復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定從而起到抗病毒的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)，對(duì)黃酮類化合物作用于COVID-19的靶點(diǎn)、通路和生物功能進(jìn)行系統(tǒng)地分析，從分子水平闡述了黃酮類化合物多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制。配合分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步論證黃酮類化合物作為防治COVID-19的潛在能力，具有一定的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性。本研究將為后期深入研究黃酮類化合物的抗病毒與抗炎機(jī)制提供合理的指導(dǎo)意義，也為臨床合理治療提供新的思路及方案。