GC 法同時(shí)測(cè)定仁術(shù)臍膏中4 種成分

曹 謙 侯雪楠 劉 宇 陳澤偉 張雙偉 張 軍*

［1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 廣東廣州510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東廣州510006； 3.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 教育部生物流變科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶大學(xué)）， 重慶400044；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科， 廣東廣州510006］

仁術(shù)臍膏是挖掘并優(yōu)化臨床經(jīng)驗(yàn)組方的在研新藥［1］，以砂仁?蒼術(shù)、肉桂?丁香藥對(duì)配伍入藥，課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)方中丁香、肉桂可增強(qiáng)砂仁、蒼術(shù)止瀉效果，并確定揮發(fā)油為其有效部位。該方外敷臍部用于防治小兒腹瀉，具有應(yīng)用方便、臨床順應(yīng)性佳等優(yōu)勢(shì)［3?7］。

目前，已上市的同類(lèi)型外用給藥制劑大多采用粉碎工藝入藥，透皮吸收緩慢，產(chǎn)品仍具“黑、大、粗” 缺陷；仁術(shù)臍膏以臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用超臨界CO2萃取浸膏入藥，以皮膚相容性較佳的混合脂肪酸甘油酯制備膏劑，具有藥效成分含有量高、吸收快、療效好、制備工藝穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用GC 法同時(shí)測(cè)定仁術(shù)臍膏中桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素的含有量［8］，以期為控制該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 GC?2010 Plus 氣相色譜儀（日本島津公司）；CP225D （十萬(wàn)分之一）、AB204?N （萬(wàn)分之一） 電子分析天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；KQ?400KDE 數(shù)控超聲波清洗器（400 W、40 kHz）。

1.2 試劑與藥物 乙酸龍腦酯（批號(hào)110759??201105，純度99.6%）、蒼術(shù)素（批號(hào)111924?201404，純度99.7%）、桂皮醛（批號(hào)110710?201619，純度98.9%）、丁香酚（批號(hào)110725?201615，純度99.8%） 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。仁術(shù)臍膏（批號(hào)170801、170802、170803，由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院制劑室提供，每貼質(zhì)量1 g，相當(dāng)于生藥4 g）。肉桂（批號(hào)160301）、砂仁（批號(hào)160501）、蒼術(shù)（批號(hào)160301） 均購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司，丁香（批號(hào)16215413） 購(gòu)于廣東省藥材公司中藥飲片廠，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張軍研究員鑒定為正品。無(wú)水乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC 條件 Phenomenex ZB?1 ms 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣高純度氮?dú)猓缓銐?00.0 kPa；進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；分流比50 ∶1；程序升溫（初始溫度130 ℃，保持10 min，10 ℃／min 升至150 ℃，保持5 min，10 ℃／min 升至180 ℃，保持5 min，20 ℃／min 升至230 ℃，保持12.5 min）；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇稀釋至25 mL 棕色量瓶中，得到相應(yīng)貯備液（三者質(zhì)量濃度分別為7.472 8、4.282 0、9.925 6 mg／mL）。精密稱(chēng)取蒼術(shù)素對(duì)照品15 mg，置于25 mL 棕色量瓶中，精密加入上述貯備液各5 mL，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（四者質(zhì)量濃度分別為1.494 6、0.856 4、1.985 1、0.613 6 mg／mL）。各精密吸取適量，依次稀釋2.5、5、12.5、25 倍，配制梯度質(zhì)量濃度溶液。

2.3 供試品溶液制備 取膏劑（批號(hào)170801） 1 貼，揭去包材，精密稱(chēng)取0.5 g，精密加入25 mL 無(wú)水乙醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲 （280 W、40 kHz） 提取30 min，4 ℃下靜置30 min后冷卻至室溫，無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 分別取缺肉桂、缺砂仁、缺丁香、缺蒼術(shù)的陰性樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液（稀釋5 倍）、陰性樣品溶液各1 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品在對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上有色譜峰，陰性無(wú)干擾。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣1 μL 測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素方程分別為Y＝155 797X-558.926 （r＝0.999 98）、Y＝150 216X-111.846（r＝1.000 00）、Y＝138 269X-889.358 （r＝0.999 97）、Y＝156 581X-143.402 （r＝0.999 99），分別在0.059 78～1.494 6、0.032 46～0.856 4、0.079 40～1.985 1、0.024 54～0.613 1 μg／μL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下同一份稀釋5 倍的對(duì)照品溶液1 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素峰面積RSD 分別為0.68%、1.35%、1.00%、1.34%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分GC 色譜圖

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批膏劑（批號(hào)170801），按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素含有量RSD 分別為0.79%、1.00%、1.13%、0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批膏劑（批號(hào)170801），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素含有量RSD 分別為0.50%、0.99%、0.61%、0.73%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取含有量已知的同一批膏劑（批號(hào)170801） 0.25 g，各6 份，精密加入“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2.8 mL、無(wú)水乙醇22.2 mL，按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取3 批膏劑，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了多種等溫或程序升溫的GC 分離條件，并進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)［9?14］，發(fā)現(xiàn)在等溫條件下主成分色譜峰出現(xiàn)出峰時(shí)間間隔過(guò)長(zhǎng)、分離度不達(dá)標(biāo)等情況，難以達(dá)到滿意的分離效果；在程序升溫條件下，初始柱溫過(guò)低會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間晚、峰型過(guò)寬等問(wèn)題，而過(guò)高又導(dǎo)致出峰時(shí)間過(guò)早、分離度差的情況，同時(shí)升溫速率過(guò)快也會(huì)導(dǎo)致主成分峰過(guò)于集中。最終，確定為“2.1” 項(xiàng)下條件，此時(shí)出峰時(shí)間適宜，峰型對(duì)稱(chēng)，分離度良好，結(jié)果穩(wěn)定。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

在制備供試品溶液時(shí)，本實(shí)驗(yàn)考察了提取方法（直接超聲提取、水浴融化后超聲提?。?、提取溶劑種類(lèi)（無(wú)水乙醇、甲醇） 及用量（25、50 mL）、提取時(shí)間（15、30、45 min）、超聲功率 （160、280、400 W）、靜置溫度（-20、0、4 ℃） 及時(shí)間（15、30、60、120 min），發(fā)現(xiàn)在以無(wú)水乙醇超聲提取或水浴后超聲提取、超聲功率280 W或400 W、提取時(shí)間30 min 或45 min 時(shí)體系澄清透明，各成分含有量均無(wú)明顯差異。為了簡(jiǎn)化操作，最終確定為“2.3” 項(xiàng)下方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立GC 法同時(shí)測(cè)定仁術(shù)臍膏中桂皮醛、乙酸龍腦酯、丁香酚、蒼術(shù)素的含有量，發(fā)現(xiàn)各成分可控程度高，而且方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可更好地控制該制劑質(zhì)量。