四君子顆粒含藥血清對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡的影響

唐保露 鄭宇辰 張葉明 袁 萍 戚小宇 張 旭 楊解人 鄭書國

（1.皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 安徽蕪湖241002； 2.皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 安徽蕪湖241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 安徽蕪湖241002； 4.皖南醫(yī)學(xué)院定量藥理研究所， 安徽蕪湖241002）

2 型糖尿病是一種以胰島素抵抗、高血糖和胰島β 細胞功能障礙為特征的代謝性疾病，其病因復(fù)雜，其中肥胖是最主要危險因素之一［1］。大多數(shù)肥胖人群血漿游離脂肪酸水平明顯升高，高水平脂肪酸對胰島β 細胞可產(chǎn)生明顯毒性作用，并可誘導(dǎo)機體發(fā)生胰島素抵抗［2］。短期暴露于高濃度游離脂肪酸，可使胰島素分泌代償性增加，而時間過長則導(dǎo)致胰島β 細胞功能損傷，甚至發(fā)生凋亡［3］。胰島β 細胞數(shù)量減少及功能損傷是發(fā)生糖尿病的主要機制之一［4］。因此抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島功能損傷和β 細胞凋亡是防治2 型糖尿病的重要措施之一。

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴” 范疇，其發(fā)生發(fā)展與脾胃關(guān)系密切，其中脾氣虧虛是糖尿病發(fā)病的重要病機，“脾虛致消” “健脾愈消” 已成為中醫(yī)治療糖尿病的重要理論依據(jù)之一，臨床以益氣健脾方治療2 型糖尿病也取得較好療效［5?6］。四君子湯是益氣健脾的經(jīng)典方劑，由黨參、白術(shù)、茯苓和甘草組成，臨床用于治療糖尿病取得了良好的效果［7］，但對其改善2 型糖尿病的確切機制，目前仍不清楚。前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，四君子顆?？擅黠@改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠糖尿病前期狀態(tài)，減少胰島細胞凋亡。本研究采用體外培養(yǎng)的小鼠胰島β 細胞株（MIN6 細胞），應(yīng)用血清藥理學(xué)方法觀察四君子湯對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞損傷和凋亡的影響，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度探究其可能機制。

1 材料

1.1 動物 30 只SD 大鼠購于浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK （浙） 2014?0001。

1.2 藥物與試劑 四君子顆粒（李時珍醫(yī)藥集團有限公司，批號20180516）；MIN6 細胞株（上海博古生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（批號AD12854263）、胎牛血清（批號MKF0602） 購自美國 HyClone 公 司；棕 櫚 酸 鈉 （批 號SLBQ0242V）、β?巰基乙醇（批號STBJ3747） 購自美國Sigma 公司；細胞凋亡檢測試劑盒 （貨號BB18061）、細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒（貨號BB18061X） 購自上海貝博生物科技有限公司；葡 萄 糖 調(diào) 節(jié) 蛋 白?78 （GRP78，批 號120617180313）、ATF4 抗體（批號011018180606）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PERK （批號66r8853）、p?PERK 抗體（批號86w3361） 購自美國Affinity Biosciences 公司；CHOP 抗體 （批號57c6807） 購自美國Cell Signaling Technology 公司；β?actin 抗體（批號20180926） 購自博士德生物工程有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒（批號20180822）購自上海天能科技有限公司。

1.3 儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國SIM 公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；DYY?6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio?Rad 公司）；Fluor chem FC3 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple 公司）；Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；手持式細胞計數(shù)儀（美國Millipore 公司）；流式細胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 30 只SD 大鼠隨機分為正常對照組及四君子顆粒高、低劑量組 （10.5、5.25 g／kg），每組10 只，除正常對照組，其余2組分別灌胃給予高、低劑量四君子顆粒（10.5、5.25 g／kg），連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h 后，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，無菌條件下分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MIN6 細胞培養(yǎng) 將MIN6 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中（含50 μmol／L β?巰基乙醇），置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細胞生長至近融合時，用0.25% 胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

2.3 MIN6 細胞活力檢測 將MIN6 細胞用0.25%胰酶消化后，制備單細胞懸液，以2×104／孔接種于96 孔培養(yǎng)板，24 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌后加入新的培養(yǎng)液，細胞隨機分為對照組、模型組、空白血清組及四君子顆粒高、低劑量組。四君子顆粒高、低劑量組分別加入相應(yīng)的含藥血清，空白血清組加入空白對照組血清，使血清終濃度為10%，孵育 24 h；除對照組外，其余各組更換含0.4 mmol／L的棕櫚酸培養(yǎng)基，孵育24 h，CCK?8 法檢測細胞活性。

2.4 MIN6 細胞凋亡檢測 取生長狀態(tài)良好的MIN6 細胞，0.25% 胰酶消化后制備單細胞懸液，接種于6 孔培養(yǎng)板，24 h 后更換新鮮培養(yǎng)液。按“2.3” 項下分組及藥物處理。棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌后0.25%胰酶消化收集細胞，預(yù)冷PBS 洗滌2次。用400 μL Annexin V 結(jié)合液懸浮細胞，在細胞懸液中加入5 μL Annexin V?FITC 染色液，輕輕混勻后于4 ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）。

2.5 Western blot 法檢測蛋白表達 細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按“2.3” 項下分組及藥物處理。棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入0.25%胰酶消化收集細胞，PIPA 裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制劑） 冰浴裂解細胞。12 000g離心15 min，收集上清液，BCA 法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入β?actin、GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK、PERK 抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度，結(jié)果以 GPR78／β?actin、ATF4／β?actin、CHOP／β?actin、P?PERK／PERK 表示。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用DAS1.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 四君子顆粒對MIN6 細胞活力的影響 由圖1可見，0.4 mmol／L 棕櫚酸孵育MIN6 細胞24 h 后可以誘導(dǎo)MIN 6 細胞損傷（P＜0.01）；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞損傷（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，空白血清組MIN 6 細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示四君子顆?？捎行Ц纳谱貦八嵴T導(dǎo)的細胞損傷。

圖1 四君子顆粒對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞損傷的影響（， n＝6）Fig.1 Effects of SGs on the viability of palmitic acid?induced MIN6 cells （， n＝6）

3.2 四君子顆粒對MIN6 細胞凋亡的影響 正常培養(yǎng)條件下，MIN6 細胞凋亡率很低，0.4 mmol／L棕櫚酸誘導(dǎo)24 h 后，MIN6 細胞凋亡率升高（P＜0.01），表現(xiàn)為凋亡早期和凋亡晚期的細胞均增加；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可降低棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡（P＜0.01），而空白對照血清對棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞凋亡無明顯影響，見圖2。提示四君子顆?？捎行б肿貦八嵴T導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡。

3.3 四君子顆粒對MIN6 細胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 表達的影響 由圖3 可知，正常培養(yǎng)條件下，MIN6 細胞GRP78、ATF4 及CHOP蛋白表達較低，PERK 蛋白磷酸化也較低；0.4 mmol／L 棕櫚酸誘導(dǎo)24 h 后，MIN6 細胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 蛋白表達升高（P＜0.01）；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可降低細胞內(nèi)GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01），而空白對照血清對GRP78、ATF4、CHOP 及p?PERK 蛋白表達均無明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可明顯減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這一作用與其抑制細胞凋亡作用一致，四君子顆粒抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細胞凋亡與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK? ATF4?CHOP 信號通路有關(guān)。

圖2 四君子顆粒對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡的影響（， n＝4）Fig.2 Effects of SGs on the apoptosis of palmitic acid?induced MIN6 cells （， n＝4）

4 討論

流行病學(xué)資料顯示，肥胖是2 型糖尿病最主要危險因素之一，糖尿病患者除表現(xiàn)為高血糖外，還普遍存在脂代謝紊亂，表現(xiàn)為血漿三酰甘油（TG）、極低密度脂蛋白（VLDL） 和游離脂肪酸等水平顯著升高［9］。大量研究顯示，高水平游離脂肪酸一方面可干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗，另一方面可誘導(dǎo)胰島β 細胞凋亡，導(dǎo)致胰島功能受損，誘發(fā)2 型糖尿病。因此，抑制高濃度游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β 細胞損傷和胰島素抵抗是防治肥胖相關(guān)2 型糖尿病的有效途徑之一。本研究采用血清藥理學(xué)方法，觀察四君子顆粒對MIN6 小鼠胰島 β 細胞的保護作用。結(jié)果顯示，0.4 mmol／L 棕櫚酸孵育24 h 后，MIN6 細胞活力明顯受損，細胞凋亡明顯升高，這一結(jié)果與文獻報道一致［10］。四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h，棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞損傷減輕，細胞凋亡也顯著下降，而空白對照血清對棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞損傷和凋亡無明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可有效改善棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞損傷和凋亡。

圖3 四君子顆粒對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 表達的影響（， n＝4）Fig.3 Effects of SGs on GRP78，ATF4，CHOP and p?PERK expression of palmitic acid?induced MIN6 cells （，n＝4）

游離脂肪酸可刺激胰島β 細胞合成與分泌胰島素，而長期暴露于高濃度游離脂肪酸則會加重β細胞胰島素分泌負荷［11］。當(dāng)胰島素合成大量增加時，作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與翻譯后加工重要場所的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔(dān)加重，大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［12］。一旦發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細胞首先啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein re?sponse，UPR） 以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。GRP78 合成增加是UPR 標(biāo)志性事件之一［13］。本研究結(jié)果顯示，暴露于棕櫚酸24 h 后，MIN6 細胞GRP78 蛋白表達顯著升高，說明棕櫚酸誘發(fā)了明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h后可明顯下調(diào)細胞內(nèi)GRP78 蛋白表達，而空白對照血清對GRP78 表達無明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可有效改善棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

生理條件下，GRP78 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白肌醇需求酶 1α （inositol?requiring enzyme 1α，IRE1α）、活化轉(zhuǎn)錄因子6 （activating transcription factor 6，ATF6） 和RNA?依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PRK like ER associated kinase，PERK） 結(jié)合而使后者處于無活性狀態(tài)。當(dāng)大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚時，一方面細胞代償性合成GRP78增加；另一方面，結(jié)合于3 種膜蛋白上的GRP78解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合未折疊蛋白，游離出的IRE?1α、PERK、ATF6 進而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游信號傳遞及相關(guān)基因表達［13］。通過上述信號通路，UPR 可改變細胞代謝方式，促使細胞存活。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于強烈或持續(xù)時間過久，UPR 無法使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)時，則可誘導(dǎo)細胞凋亡。IRE?1α、PERK和ATF6 通路的活化均可上調(diào)CHOP 蛋白表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，其中PERK 途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡中發(fā)揮主要作用［14］。本研究結(jié)果顯示，與棕櫚酸孵育24 h 后，MIN6 細胞內(nèi)ATF4 蛋白、磷酸化PERK 及其下游蛋白CHOP 表達均顯著升高，而與四君子顆粒含藥血清預(yù)孵可明顯抑制上述蛋白表達，這一作用與四君子顆粒含藥血清抑制MIN6細胞凋亡作用一致，提示四君子顆粒含藥血清抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡與抑制細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK 相關(guān)凋亡信號通路有關(guān)。

綜上所述，四君子顆粒含藥血清可有效抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細胞凋亡，其機制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK 信號通路有關(guān)。該研究結(jié)果提示，四君子顆粒防治2 型糖尿病可能與保護胰島β 細胞、改善胰島功能有關(guān)。