甜橙bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及生物信息學(xué)分析

孟富宣 楊玉皎 段元杰 呂陟遠(yuǎn) 陸曉英 郭淑萍 劉海剛

( 云南省農(nóng)業(yè)科研學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所/元謀干熱河谷植物園，云南 楚雄 651399)

轉(zhuǎn)錄因子（TF），又稱為反式作用因子，通常包含4個(gè)功能區(qū)，即DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域、核定位信號(hào)和寡聚位點(diǎn)[1-6]。目前的研究中，發(fā)現(xiàn)植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)超過60個(gè)，根據(jù)DNA結(jié)合域中賴氨酸和精氨酸殘基的數(shù)量，把轉(zhuǎn)錄因子分為四類，即鋅指型（ZF）、螺旋轉(zhuǎn)螺旋型（HLH）、堿性螺旋環(huán)螺旋型（bHLH）和堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）。迄今為止，在高等植物中發(fā)現(xiàn)的最常見的轉(zhuǎn)錄因子家族是WD40、MYB、WRKY、bHLH和bZIP家族[7]。

bHLH TFs廣泛存在于真核生物中，是繼MYB家族之后的第2大家族[8-9]。bHLH TFs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含約60個(gè)氨基酸，在轉(zhuǎn)錄因子序列的N端包含10～15個(gè)氨基酸的基本區(qū)域和約40個(gè)氨基酸的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域，并且主要負(fù)責(zé)TFs與特定DNA序列的結(jié)合[9-13]。研究表明，同一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的2個(gè)α-螺旋或不同的bHLH TF的α-螺旋之間相互作用形成同源或異源二聚體，這些二聚體可以針對(duì)基因啟動(dòng)子的不同部分來調(diào)節(jié)目標(biāo)基因[14-15]。與高度保守的BHLH結(jié)構(gòu)域不同，TF序列的其余部分通常差異非常大。在靶基因啟動(dòng)子中，bHLH TFs主要與E-box序列（5′-CANNTG-3′）結(jié)合，最常見的形式是重復(fù)的Gbox（5′-CACGTG-3′）。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中幾個(gè)保守的氨基酸決定了轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同E-boxes核心序列位點(diǎn)的特異性[3,16]。Atchley等人根據(jù)動(dòng)物bHLH TFs的進(jìn)化關(guān)系和序列相似性將動(dòng)物bHLH TFs分為6組（A-F）[10,17]。Heim等人發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物的bHLH TFs屬于B組[11]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，bHLH TF家族的多樣性已被揭示，植物bHLH TFs基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[14]、水稻（Oryza sativa）[13]、番茄（Solanum lycopersicum）[18]、短柄草（Brachypodium sylvaticum）[19]、花生（Arachis hypogaea）[20]和丹參（Salvia miltiorrhiza）[21]等多種植物中已經(jīng)得到鑒定。高等植物的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，是通過DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。已發(fā)現(xiàn)雌性藤本植物開花過程是由SPT和HEC編碼基因共同調(diào)控的[22]。在擬南芥中，光形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)主要通過光敏色素調(diào)控基因相互作用來實(shí)現(xiàn)的[23]。在轉(zhuǎn)錄水平上，一般通過TF和相關(guān)基因的聯(lián)合調(diào)控來實(shí)現(xiàn)高等植物逆境應(yīng)答的調(diào)控。Abe等人發(fā)現(xiàn)擬南芥中RD22的產(chǎn)生主要是由干旱脅迫和脫落酸（ABA）的誘導(dǎo)。RD22啟動(dòng)子區(qū)含有MYC（bHLH）和MYB 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與這些位點(diǎn)特異結(jié)合以調(diào)節(jié)基因表達(dá)[24-25]。

bHLH TFs還參與植物次生代謝，由R基因編碼的玉米（Zea mays）Lc蛋白是植物中首次報(bào)道的bHLH TF，并且發(fā)現(xiàn)其在玉米花青素代謝途徑中調(diào)控至少2個(gè)結(jié)構(gòu)基因[26]。Goodrich等人從金魚草（Antirrhinum majus）中克隆得到Delila基因，該基因編碼具有與玉米R(shí)基因家族編碼的蛋白質(zhì)相似的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，隨后證實(shí)Ddila基因的表達(dá)與花色素苷的積累密切相關(guān)[27]。參與擬南芥花色素苷合成調(diào)控的bHLH TFs屬于第III亞組，其中包括TT8、EGL3、GL3和MYCI TF家族[11,28]。

柑橘（Citrus reticulata）是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生木本果樹作物之一，是世界第一大水果，全世界的總產(chǎn)量達(dá)1.2億t，居所有水果之首[29]。柑橘主要在我國(guó)南方地區(qū)種植，栽培面積達(dá)229萬hm2，產(chǎn)量達(dá)到2 944萬t。本研究以甜橙（Citrus sinensis）為試驗(yàn)材料，通過全基因組數(shù)據(jù)庫搜索鑒定，共鑒定出126個(gè)CsbHLH基因，并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體分布、保守基序、蛋白互作生物信息學(xué)分析，并分析了它們?cè)诓煌M織的表達(dá)情況。為CsbHLH基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)，并有助于bHLH基因在其他植物物種中的功能研究。

1 材料與方法

1.1 甜橙bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

從柑橘基因組數(shù)據(jù)庫中下載了CsbHLH序列（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）。使 用Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.janelia.org/search/sequence）中的隱馬爾可夫模型（HMM）文件進(jìn)行本地BLAST（Evalue-5）搜索，以篩選所有候選CsbHLH基因序列。保留含有已知保守結(jié)構(gòu)域的候選基因，并通過對(duì)Pfam，NCBI Conserved Domains（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫的核對(duì)以確定bHLH結(jié)構(gòu)域（PF00010）的存在[30]。利用BLSATP方法在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（TAIR;https://www.arabidopsis.org/）獲得甜橙bHLH同源基因的相關(guān)注釋信息，參數(shù)為默認(rèn)值[31]。擬南芥bHLH基因序列分別從擬南芥信息資源（TAIR）網(wǎng)站下載。對(duì)CsbHLH、AtbHLH序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并使用ExPASy（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）計(jì)算理化參數(shù)，MW、pI和GRAVY等。

1.2 甜橙bHLH基因的系統(tǒng)發(fā)育和多重序列比對(duì)分析

用MEGA 6.0中的鄰距法（NJ，Neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中校驗(yàn)參數(shù) Bootstrap=1 000。利用MEGA 6.0構(gòu)建CsbHLH基因的個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育樹和來自2個(gè)物種（AtbHLH和CsbHLH）的bHLH基因的綜合系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)甜橙bHLH基因家族進(jìn)行分類。使用ClustalX 2.11對(duì)CsbHLH基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。

1.3 甜橙bHLH基因保守基序分析

利用在線MEME系統(tǒng)（http://meme.sdsc.edu/meme/itro.html）來識(shí)別保守基序，參數(shù)設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)“任意”，最高基序數(shù)“20”，基序長(zhǎng)度“6-200”，其他均為默認(rèn)值。

1.4 甜橙bHLH基因的染色體位置和基因重復(fù)

通過使用來自支架的染色體定位和注釋信息來探索FRO基因在染色體上的分布，并且使用公開可用的數(shù)據(jù)庫和Map Draw軟件來根據(jù)物理位置顯示精確的基因位置。還通過使用植物基因組復(fù)制數(shù)據(jù)庫（PGDD，http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus）在FRO基因家族中進(jìn)行基因重復(fù)分析。

1.5 甜橙bHLH蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)

利用 String 蛋白互作數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）對(duì)126 個(gè)bHLH蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，物種參數(shù)選擇模式植物擬南芥。

1.6 甜橙bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

甜橙RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)來自Citrus sinensis Annotation project數(shù)據(jù)庫，利用Matrix2png interface軟件對(duì)甜橙bHLH家族基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，綠、黑、紅3個(gè)顏色表示基因的表達(dá)強(qiáng)度，綠色越強(qiáng)代表表達(dá)量越小，紅色越強(qiáng)代表表達(dá)量越大，黑色為中間值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橙中bHLH基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

研究者利用是否含有保守結(jié)構(gòu)域bHLH基序（PF00010），在擬南芥[14]中鑒定出bHLHTFs 144條，鑒于此，利用該保守結(jié)構(gòu)域鑒定柑橘中的bHLH基因，然后通過NCBI BlastP 和Citrus Sinensis Annotation Project數(shù)據(jù)庫（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php）在柑橘基因組中搜索驗(yàn)證，最終獲得126個(gè)bHLH基因（表1）。其內(nèi)含子數(shù)目介于0～12之間，其中CsbHLH002、CsbHLH012、CsbHLH041、CsbHLH068、CsbHLH124、CsbHLH126不含有內(nèi)含子，CsbHLH087最多含12個(gè)內(nèi)含子。

表 1 甜橙中鑒定出的CsbHLH基因家族成員及其基本特性Table 1 The CsbHLH gene family members in C. sinensis and their basic characteristics

續(xù)表 1

續(xù)表 1

續(xù)表 1

根據(jù)基因在染色體上的位置，將甜橙126個(gè)bHLH基因分別命名為CsbHLH001～CsbHLH126，編碼氨基酸數(shù)從79（CsbHLH003）～762（CsbHLH067），平均長(zhǎng)度為359個(gè)氨基酸。通過Ex-pasy預(yù)測(cè)其分子量大小為9.40～83.84 kD，等電點(diǎn)為4.42（CsbHLH069）～11.68（CsbHLH102）。從以上理化性質(zhì)來看，雖然bHLH TFs的保守結(jié)構(gòu)域中存在堿性區(qū)域，但酸性氨基酸富集于蛋白質(zhì)分子中，因此65.87%的甜橙bHLH家族蛋白等電點(diǎn)小于7，大部分呈弱酸性，此現(xiàn)象與擬南芥[14]及水稻[13]相同。甜橙中bHLH家族蛋白總平均親水性在?1.005～?0.034之間，均為負(fù)值，說明該家族蛋白均屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)介于35.17～93.56之間，其中94.44%是不穩(wěn)定蛋白（II＞40），只有7個(gè)屬于穩(wěn)定蛋白（II＜40）；脂肪指數(shù)介于49.75～112.35之間；通過在線軟件TargetP和CELLO v2.5對(duì)126個(gè)甜橙bHLH蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示大部分分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體以及線粒體基質(zhì)上。甜橙126條bHLH蛋白經(jīng)SignalP預(yù)測(cè)分析，均不存在信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白。

2.2 甜橙bHLH基因的染色體定位與分布

bHLH轉(zhuǎn)錄因子在甜橙連鎖群上的分布如圖1所示。CsbHLH001～CsbHLH112在9條染色體中呈不均勻分布，“ChrUn”表示的是CsbHLH113～CsbHLH126基因存在于連鎖群上，但不能定位到連鎖群的骨架，還需進(jìn)一步的基因組測(cè)序信息才能確定；其中7號(hào)染色體上分布最多為17條，4號(hào)染色體最少為7條。一般認(rèn)為，基因之間的距離小于100 kb的即為串聯(lián)復(fù)制，分析發(fā)現(xiàn)，甜橙染色體上存在基因串聯(lián)復(fù)制現(xiàn)象的有Chr1上的CsbHLH010和CsbHLH011；Chr2上的CsbHLH016和CsbHLH017，CsbHLH026和CsbHLH027；Chr3上 的CsbHLH039、CsbHLH040和CsbHLH041；Chr5上 的CsbHLH052和CsbHLH053；Chr6上 的CsbHLH067和CsbHLH068；Chr7上的CsbHLH080和CsbHLH081；Chr8上的CsbHLH099、CsbHLH100和CsbHLH101；Chr9上的CsbHLH106和CsbHLH107，CsbHLH109和CsbHLH110。

圖 1 甜橙bHLH基因在染色體上的定位Fig. 1 Chromosomal locations of C. sinensis bHLH gene family

2.3 甜橙與擬南芥bHLH基因家族的進(jìn)化關(guān)系

為了研究甜橙bHLH基因家族的進(jìn)化關(guān)系，利用鑒定出的 126條甜橙bHLH蛋白序列與144條擬南芥bHLH蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。根據(jù)擬南芥中bHLH TFs的分類系統(tǒng)和甜橙bHLH TFs進(jìn)化樹的分類情況，全部成員分為16個(gè)亞族，其中第XVI亞族中的bHLH成員數(shù)量最多，共19個(gè)，第I、V亞族中的成員數(shù)量最少，僅為2個(gè)。甜橙與擬南芥在第I、II、III、IV、V、VI、XI、XIII和XV共9個(gè)亞家族中的成員數(shù)量相同或相似，差異最大的是第XII 亞族，甜橙bHLH數(shù)量不及擬南芥的50%，而第I、III和XVI亞族中的bHLH成員數(shù)量均多余擬南芥，以上結(jié)果表明甜橙bHLH家族基因歷史演變的過程中發(fā)生了基因擴(kuò)增或收縮。

圖 2 甜橙和擬南芥bHLH基因家族的進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on C. sinensis and arabidopsis bHLH transcription factors

2.4 甜橙bHLH家族基因保守基序分析

通過多序列比對(duì)和SMART分析發(fā)現(xiàn)，甜橙126個(gè)蛋白序列均含有bHLH結(jié)構(gòu)域。根據(jù)鑒定出的甜橙CsbHLH基因的保守結(jié)構(gòu)域序列，構(gòu)建甜橙系統(tǒng)進(jìn)化拓?fù)鋱D，得到的結(jié)果與圖2中所示的進(jìn)化關(guān)系是基本一致的。甜橙bHLH保守基序進(jìn)行分析結(jié)果如圖3所示，每一個(gè)亞家族之間的轉(zhuǎn)錄因子盡管它們的長(zhǎng)度差別很大，但是它們的保守基序長(zhǎng)度及位置都很相似。motif1-10在圖中用不同的顏色表示，10個(gè)保守基序的詳細(xì)信息如表2所示。除bHLH保守結(jié)構(gòu)域外，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族還含有其他保守型的結(jié)構(gòu)域，但Motif1和Motif2總是相鄰，兩者共同構(gòu)成了bHLH結(jié)構(gòu)域。這些保守元件是轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其調(diào)控作用所必需的，對(duì)于維持蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象和與靶基因的結(jié)合至關(guān)重要。

2.5 甜橙bHLH蛋白互作關(guān)系

甜橙bHLH蛋白互作預(yù)測(cè)分析繪制出調(diào)控圖如（圖4）所示。在植物生長(zhǎng)和次生代謝中bHLH TFs起重要作用，而且多種植物脅迫反應(yīng)中也有bHLH TFs的參與。在甜橙中bHLH104與ILR3可以協(xié)同作用調(diào)控PYE基因的表達(dá)，而PYE是植物鐵吸收相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MYC2和MYC4協(xié)同調(diào)控了擬南芥的開花誘導(dǎo)，甜橙中MYC2和MYC4也具有協(xié)同調(diào)控作用。ICE1與SPCH、MUTE、FAM和bHLH093相互作用，正調(diào)控氣孔的發(fā)育。AMS、DYT1和AT2G31210之間具有協(xié)同作用，且AMS和DYT1對(duì)植物花器官發(fā)生、形成、生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)控作用，因此三者可能協(xié)同調(diào)控甜橙花器官的發(fā)生、形成及生長(zhǎng)發(fā)育。甜橙中光敏色素互作蛋白PIL5、PIL6、PIF3和PIF7共同作用來調(diào)節(jié)光形態(tài)發(fā)生。

2.6 甜橙bHLH基因在不同器官表達(dá)情況

對(duì)甜橙126個(gè)bHLH基因在愈傷組織、花、葉、果實(shí)、混合樣（Mixture1：幼果果肉果皮，Mixture:2：生長(zhǎng)中期的果肉果皮，Mixture3：成熟期果肉果皮）的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖5所示，CsbHLH013、CsbHLH047、CsbHLH062、CsbHLH105、CsbHLH02054、CsbHLH043、CsbHLH126、CsbHLH063、CsbHLH059、CsbHLH075、CsbHLH061、CsbHLH115、CsbHLH07313個(gè)基因在愈傷組織、花、葉、果實(shí)及混合樣均大量表達(dá)。其中CsbHLH043（LRL1）在愈傷組織中的表達(dá)量最大，CsbHLH124（MYC4）在花和葉片中的表達(dá)量均最大，CsbHLH115在果實(shí)中的表達(dá)量最大，在組織中高度表達(dá)的CsbHLH基因可能具有相似的作用。

圖 3 甜橙bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析Fig. 3 The conserved motifs analysis of C. sinensis bHLH transcription factors

圖 4 甜橙CsbHLHs蛋白功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 CsbHLHs protein function control network of C. sinensis

表 2 甜橙 bHLH 基因的保守基序Table 2 The conserved motifs of C. sinensis bHLH genes

圖 5 甜橙bHLH基因在不同組織的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of bHLH gene in different tissues of C. sinensis

3 結(jié)論與討論

bHLH家族在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族中是一個(gè)大家族，并在生物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理及新陳代謝過程中發(fā)揮著一系列的重要調(diào)節(jié)作用[32]。已經(jīng)在諸如蘋果（Malus domestica）[33]、櫻桃（Cerasus pseudocerasus）[34]、短柄草[19]和擬南芥[14]等植物中鑒定了bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其生長(zhǎng)與生物和非生物脅迫之間的關(guān)系也做了研究。耿晶晶的研究報(bào)道鑒定出56個(gè)甜橙bHLH家族成員，并分析了其在低溫脅迫下的表達(dá)模式[35]。在本研究中，利用生物信息學(xué)的手段對(duì)甜橙中的bHLH TFs進(jìn)行鑒定，并對(duì)其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體上的位置分布及在不同組織中的表達(dá)情況等方面進(jìn)行了分析，為bHLH基因家族在基因表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能等研究提供參考，為揭示bHLH家族基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的調(diào)控提供參考。

通過分析驗(yàn)證從甜橙中鑒出了126個(gè)bHLH基因（表1），根據(jù)基因在染色體上的位置，將柑橘126個(gè)bHLH基因分別命名為CsbHLH001～CsbHLH126，bHLH保守結(jié)構(gòu)域是由HLH區(qū)和堿性氨基酸區(qū)和兩部分組成。研究者發(fā)現(xiàn)，在番茄bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中同樣存在高度保守的Glu9、His5、Arg13及 Arg10 等氨基酸殘基，在HLH區(qū)也存在高度保守的氨基酸殘基Leu23 和 Leu64[18]。HLH區(qū)的保守氨基酸殘基與二聚體形成相關(guān)，而堿性氨基酸區(qū)保守氨基酸殘基與靶基因的結(jié)合緊密相關(guān)。

基因結(jié)構(gòu)和染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，甜橙bHLH基因家族內(nèi)含子數(shù)量差異較大，基因在染色體上的分布也不均勻（圖1），基因復(fù)制是基因重組以及擴(kuò)增的最主要途徑，其主要包括串聯(lián)重復(fù)和大片段復(fù)制2種方式[36]。串聯(lián)重復(fù)是指在同一條染色體的2個(gè)相鄰基因，大片段復(fù)制事件發(fā)生在不同染色體上[37]。本研究中，126個(gè)CsbHLH基因中的22個(gè)（17.4%）參與到串聯(lián)重復(fù)事件中；雖然基因復(fù)制事件不多，但依然可以推測(cè)，基因復(fù)制是甜橙bHLH基因家族擴(kuò)增的主要模式。串聯(lián)復(fù)制的序列與保守區(qū)域非常的相似，進(jìn)化樹中的它們的親緣關(guān)系也很近，因此推測(cè)，在進(jìn)化的過程中他們的功能也類似，但還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。通過在線軟件 MEME 對(duì)甜橙126條bHLH基因的保守基序進(jìn)行分析，從中找到了10 個(gè)高度保守氨基酸基序，保守基序分析顯示，同一亞家族中的大多數(shù)保守基序相似，表明每個(gè)亞家族中編碼蛋白的功能是穩(wěn)定的，Motif1和Motif2幾乎存在于所有的CsbHLH蛋白中，且總是相鄰，共同構(gòu)成bHLH結(jié)構(gòu)域，綜上，所有這些bHLH保守基序在同一亞家族的獨(dú)特性及保守性也是對(duì)甜橙bHLH基因家族的進(jìn)化分類的佐證，同時(shí)推測(cè)，除bHLH結(jié)構(gòu)域外的其他保守基序也是每個(gè)亞家族發(fā)揮其相應(yīng)功能的關(guān)鍵。

為了研究甜橙bHLH基因家族的進(jìn)化關(guān)系，本研究把126個(gè)bHLH 劃分為16個(gè)亞族，同一亞家族內(nèi)的成員大都具有相同的內(nèi)含子模式和保守基序。bHLH TFs家族成員數(shù)量巨大，對(duì)其進(jìn)行分類有一定難度。bHLH TFs參與植物多種調(diào)控代謝活動(dòng)。

已發(fā)現(xiàn)植物開花過程是由SPT和HEC編碼基因共同調(diào)控的[22]，Zhang等[38]通過擬南芥突變株DYT1花藥發(fā)育不良證實(shí) DYT1是花藥發(fā)育的必須調(diào)控因子，可以與bHLH010，bHLH089 和bHLH090通過互作來調(diào)節(jié)擬南芥的花藥發(fā)育和轉(zhuǎn)錄表達(dá)[39]。預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)AMS、DYT1和AT2G31210可能協(xié)同調(diào)控甜橙花器官的發(fā)生、形成及生長(zhǎng)發(fā)育，而MYC2和MYC4協(xié)同調(diào)控甜橙的開花過程。ICE1調(diào)控CBF/DRB1基因的冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，與CBF3/DREB1A啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的MYC識(shí)別位點(diǎn)（5'-CANNTG-3'）特異性結(jié)合，通過與SPCH、MUTE和FAMA等的相互作用控制氣孔細(xì)胞分化及保衛(wèi)細(xì)胞的形成[40]。本研究中ICE1與SPCH、MUTE、FAM和bHLH093相互作用，對(duì)甜橙氣孔的發(fā)育有正調(diào)控作用。根據(jù)Huq和Peter H.Quail的研究結(jié)果，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子HFR1、PIF3和PIF4在光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[41]。甜橙中光敏色素互作蛋白PIL5、PIL6、PIF3和PIF7共同作用來調(diào)節(jié)光形態(tài)發(fā)生。參與擬南芥花色素苷合成調(diào)控的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子包括TT8、EGL3、GL3和MYCI TF家族[11]，Zimmermann等人發(fā)現(xiàn)它們都與R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子相互作用，包括PAP1（AtMYB75）和PAP2（AtMYB90），TT8與MYB75/PAP1或MYB90/PAP2相互作用，參與調(diào)控黃酮類色素沉著，在調(diào)節(jié)無色花色素還原酶（BANYULS）和二氫黃酮-4-還原酶（DFR）中起關(guān)鍵作用[42]。分析與甜橙發(fā)育相關(guān)的組織表達(dá)數(shù)據(jù)，為CsbHLH基因家族提供了初步的器官特異性表達(dá)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步闡明這些基因在甜橙的進(jìn)化發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。