干旱脅迫下PGPR對(duì)紅棗植株生長(zhǎng)及生理特性的影響

張 敏 王 迎 楊 琳 郝汝倩 白曉雄 余 旋

( 1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 國(guó)家林業(yè)局黃土高原林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；3. 陜西省林業(yè)綜合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

受全球氣候變化和人類活動(dòng)的影響，干旱成為制約農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的主要因素[1]。在干旱半干旱地區(qū)，大多數(shù)水果作物經(jīng)常處于缺水狀態(tài)，嚴(yán)重影響了果樹的生長(zhǎng)、果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，灌溉和選育耐旱品種等傳統(tǒng)的抗旱措施費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此在干旱半干旱地區(qū)如何才能使植物更好地應(yīng)對(duì)干旱環(huán)境，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

植物根際促生細(xì)菌（PGPR）是指生存在植物根圈范圍內(nèi)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌的一類有益細(xì)菌[2]。在干旱脅迫下，PGPR可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加干物質(zhì)積累，修復(fù)干旱脅迫對(duì)植物的危害[3-4]。其緩解干旱脅迫的機(jī)制如下：1）改變植物激素的濃度或產(chǎn)生植物激素；2）溶解礦物磷質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)素；3）誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等[3,5-6]。目前大量研究表明，芽孢桿菌屬（Pseudomonas）和假單胞菌屬（Bacillus）PGPR可提高植物抗逆性[7-8]。然而，對(duì)PGPR緩解干旱脅迫的研究，多以農(nóng)作物為接種對(duì)象，且集中在對(duì)株高和生物量的影響上[9-10]。以木本植物作為接種對(duì)象，研究PGPR緩解干旱脅迫的報(bào)道相對(duì)較少[11-12]。

紅棗（Zizyphus jujuba）作為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)林木之一，因其果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)保健功能越來(lái)越受到重視，棗樹主要分布在我國(guó)干旱和半干旱地區(qū)[13]。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖，干旱和半干旱地區(qū)也出現(xiàn)了嚴(yán)重的缺水，土壤含水量為3%～36%[14-15]。孫浩元等[16]研究顯示，當(dāng)土壤含水量達(dá)到3%時(shí)，棗苗會(huì)永久萎蔫；在果實(shí)硬核后的緩慢生長(zhǎng)期，當(dāng)田間持水量處于30%～50%時(shí)，紅棗果肉細(xì)胞生長(zhǎng)停止，導(dǎo)致棗果變小引發(fā)的減產(chǎn)。艾鵬睿等[17]研究表明，灰棗產(chǎn)量在重度水分虧缺時(shí)較充分灌溉處理減產(chǎn)18%。因此，干旱成為制約我國(guó)干旱半干旱地區(qū)紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[18]。目前，生產(chǎn)上主要通過(guò)施用保水劑、覆蓋薄膜抑制蒸發(fā)和選育抗旱品種的方法，來(lái)緩解干旱脅迫對(duì)植物的危害[19-21]，但傳統(tǒng)的抗旱措施成本高、耗時(shí)耗力。因此，本研究擬采用盆栽試驗(yàn)，以1年生紅棗植株為供試材料，探索不同干旱脅迫程度下PGPR對(duì)紅棗植株生長(zhǎng)及生理特性的影響，旨在為旱地紅棗種植以及促生菌資源的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植株為紅棗（Zizyphus jujuba）品種“七月鮮”1年生嫁接苗，由西北農(nóng)林科技大學(xué)清澗紅棗試驗(yàn)站提供。

供試菌株為紅棗根際促生細(xì)菌Pseudomonas koreensis和Bacillus filamentosus，由作者前期從干旱半干旱地區(qū)紅棗植株根際土壤分離獲得。2株菌株均具有分泌ACC脫氨酶、產(chǎn)胞外多糖、固氮和解磷的能力。P. koreensis和B. filamentosus均具有一定的抗旱能力，能在水勢(shì)為?0.30 MPa中存活。前期的定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，這2株菌株均能在土壤中定殖。接種到土壤中90 d后菌群數(shù)量趨于穩(wěn)定，分別為4.69×106cfu/mL和4.24×106cfu/mL。

供試土壤采自西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗(yàn)林場(chǎng)。采樣深度為0～20 cm，土壤質(zhì)地為沙壤土，土壤理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)11.25 g/kg，全氮0.84 g/kg，全磷0.32 g/kg，堿解氮47.80 mg/kg，速效磷3.60 mg/kg，速效鉀42.15 mg/kg。樣土風(fēng)干經(jīng)0.1%（占干質(zhì)量）的甲醛溶液熏蒸滅菌后過(guò)1 mm篩，并與過(guò)1 mm篩的河沙以體積比3∶1混勻后備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素A為菌劑，因素B為水分脅迫。因素A菌劑設(shè)4個(gè)處理：1）接種P. koreensis菌劑150 mL（T1）；2）接種B. filamentosus菌劑150 mL（T2）；3）接種混合菌劑（V（T1）∶V（T2）=1∶1）150 mL（T3）；4）接種無(wú)菌的空白LB液體培養(yǎng)基150 mL為對(duì)照（ck）。因素B水分脅迫參照前人對(duì)紅棗植株干旱耐受性研究[22-23]和預(yù)備試驗(yàn)，分為4個(gè)水平：無(wú)水分脅迫（ND，田間持水量的65%～70%）、輕度水分脅迫（LD，田間持水量的50%～55%）、中度水分脅迫（MD，田間持水量的35%～40%）、重度水分脅迫（SD，田間持水量的20%～25%）。試驗(yàn)共計(jì)16種處理，每個(gè)處理重復(fù)10次，共160盆。

本試驗(yàn)于2018年5月起，在西北農(nóng)林科技大學(xué)有防雨棚的林木育苗苗圃進(jìn)行。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生紅棗植株定植于18 cm×25 cm（高×口徑）且裝有5 kg無(wú)菌土的花盆中。定植時(shí)每盆均按N 300 mg/kg、P2O5300 mg/kg、K2O 300 mg/kg施入氮肥（尿素）、磷肥（磷酸二氫鉀）和鉀肥（硝酸鉀）。

待植株移栽成活后，立即在其根際周圍用無(wú)菌注射器注射濃度為108cfu/mL的各處理菌劑150 mL，對(duì)照組注射空白LB液體培養(yǎng)基150 mL。在接菌7 d后，進(jìn)行干旱脅迫，并持續(xù)脅迫10 d。期間為了使各干旱處理組的土壤含水量接近目標(biāo)值，每天對(duì)花盆進(jìn)行兩次稱量，并根據(jù)需要澆水[24]。選擇晴天上午9：00—11：00測(cè)定植株光合作用。待脅迫完成后，每個(gè)處理取5株試驗(yàn)苗，將其全部收獲后，測(cè)量植株株高和生物量；另外，每個(gè)處理取5株植株，選取相同位置的功能葉片，測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

株高采用卷尺測(cè)量，生物量烘干后采用稱重法測(cè)定，葉片相對(duì)水分含量根據(jù)李合生[25]的方法測(cè)定，光合作用參數(shù)（凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度）用Li-6400便攜式光合系統(tǒng)測(cè)定儀測(cè)定，葉綠素含量采用分光光度法測(cè)定，過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）法測(cè)定，脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮顯色法測(cè)定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定，植株葉片IAA和ABA激素含量采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定（Phytodetek-IAA和Phytodetek-ABA檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Agdia公司），每個(gè)樣品重復(fù)5次，取其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素（one-way ANOVA）方差分析和多重比較（LSD法，α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下PGPR對(duì)植株生長(zhǎng)特性及葉片相對(duì)水分含量的影響

如圖1所示，中、重度水分脅迫顯著影響紅棗苗木的生長(zhǎng)，地上部和地下部干物質(zhì)的積累以及葉片相對(duì)水分含量（P＜0.05）。接種菌劑T1、T2或T3顯著促進(jìn)了干旱脅迫下紅棗苗木的生長(zhǎng)和葉片相對(duì)水分含量的提高（P＜0.05）。在不同干旱脅迫程度下，各接菌處理組株高、地上、地下部干質(zhì)量和葉片相對(duì)水分含量均較對(duì)照（ck）顯著增加（P＜0.05），且增加幅度隨干旱脅迫程度的加劇而增加。在重度水分脅迫下，除T2處理組的地下部干質(zhì)量和T1、T2處理組的葉片相對(duì)水分含量顯著低于無(wú)水分脅迫的對(duì)照組外（P＜0.05），其他處理組的地上、下部干質(zhì)量和T1、T2處理組的株高均與無(wú)水分脅迫的對(duì)照組無(wú)差異，且T3處理組的株高和葉片相對(duì)水分含量均顯著高于無(wú)水分脅迫的對(duì)照組（P＜0.05）。其中各菌劑接種處理組中，以混合菌劑T3效果最佳，在中度水分脅迫下，植株株高、地上部、地下部干質(zhì)量和葉片相對(duì)水分含量分別是其余處理組的1.12～1.68倍、1.10～1.48倍、1.10～1.35倍 和1.09～1.32倍。

2.2 干旱脅迫下PGPR對(duì)植株光合特性及葉綠素的影響

紅棗葉片的氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、胞間CO2濃度和葉綠素含量，均隨干旱脅迫程度的增加而下降。但在干旱脅迫下，接種T1、T2或T3菌劑植株的上述各項(xiàng)光合指標(biāo)和葉綠素含量，均高于對(duì)照處理組植株。由圖2a、b、d可見，接種各菌劑處理后，植株氣孔導(dǎo)度、凈光合速率和葉綠素含量在中、重度水分脅迫條件下，均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。其中，中、重度水分脅迫下，各菌劑處理組植株的凈光合速率平均值、氣孔導(dǎo)度平均值和葉綠素含量平均值，分別較對(duì)照增加了69.4%、52.4%和39.8%。而對(duì)于植株胞間CO2濃度，只有重度水分脅迫下的T3菌劑處理組顯著高于對(duì)照（P＜0.05，圖2c）。同時(shí)在這4種水分處理中，混合菌劑T3處理組苗木的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量均高于其他處理組，且部分達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖 1 不同干旱脅迫下T1、T2和T3對(duì)紅棗植株生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of T1, T2 and T3 on plant growth of Z. jujuba seedlings under different drought stress

圖 2 不同干旱脅迫下T1、T2和T3對(duì)紅棗葉片葉綠素含量及光合特性的影響Fig. 2 Effects of T1, T2 and T3 on plant chlorophyll content and photosynthetic characteristics of Z. jujuba leaves under different drought stress

2.3 干旱脅迫下PGPR對(duì)植株生理生化特性的影響

由圖3a、b、c可知，無(wú)論是否接種PGPR菌劑，紅棗葉片內(nèi)過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和脯氨酸（Pro）含量均隨干旱強(qiáng)度的增加，呈逐漸上升趨勢(shì)。各接菌處理組的增加幅度均高于對(duì)照處理組，且隨干旱脅迫程度的加劇具有顯著性差異（P＜0.05）。在重度干旱脅迫下，各菌劑處理組葉片中POD、SOD和Pro含量較對(duì)照分別增加22.0%～39.4%、19.5%～30.5%和14.0%～17.7%。同時(shí)，接種菌劑還會(huì)降低葉片內(nèi)隨干旱脅迫程度加劇而逐漸升高的丙二醛（MDA）含量，并且隨脅迫程度的加劇各處理組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3d）。其中，重度干旱脅迫下接種T1、T2或T3菌劑，MDA含量較對(duì)照分別顯著降低25.5%、20.9%和43.1%。各處理組中以混合菌劑T3的處理效果最佳，其葉片中MDA含量在各水分脅迫程度下，均能達(dá)到無(wú)水分脅迫對(duì)照處理的水平。

圖 3 不同干旱脅迫下T1、T2和T3對(duì)紅棗葉片脯氨酸含量及抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effects of T1, T2 and T3 on plant Pro content and antioxidant enzyme activity of Z. jujuba leaves under different drought stress

2.4 干旱脅迫下PGPR對(duì)紅棗植株內(nèi)源激素的影響

隨著干旱脅迫程度的加劇，紅棗葉片中吲哚乙酸（IAA）含量逐漸降低，脫落酸（ABA）含量逐漸增加。由圖4a可知，在各干旱脅迫程度下，接菌處理組IAA含量均顯著高于對(duì)照（ck）（P＜0.05）。在輕、中和重度水分脅迫下，其IAA含量的平均值分別是對(duì)照的1.48倍、1.42倍和1.77倍。相反，ABA含量在各干旱脅迫程度下接種菌劑后，均有不同程度的降低（圖4b）。在中度和重度水分脅迫下同對(duì)照相比，接種T1和T3后ABA含量顯著降低（P＜0.05），其在重度水分脅迫下較對(duì)照減少12.6%和21.3%。在各水分脅迫程度下，混菌T3處理組的IAA含量均為最高，ABA含量最低，且部分達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖 4 不同干旱脅迫下T1、T2和T3對(duì)紅棗葉片激素含量的影響Fig. 4 Effects of T1, T2 and T3 on plant hormone content of Z. jujuba leaves under different drought stress

3 結(jié)論與討論

干旱脅迫下，植物細(xì)胞中積累的脅迫乙烯會(huì)激活葉綠素酶基因，導(dǎo)致葉綠素分解，降低光合作用，影響植株根系和莖部生物量的積累[26]，并且葉片中的氣孔往往也會(huì)部分或全部關(guān)閉，以降低蒸騰速率，這在減少水分散失的同時(shí)，也減少了CO2的進(jìn)入，導(dǎo)致光合速率下降[27]。PGPR對(duì)植物生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用[28]。Sandhya等[29]研究表明，接種產(chǎn)胞外多糖的Pseudomonas putida可以提高土壤對(duì)水分的吸收。本研究在不同干旱脅迫程度下，接種具有固氮、解磷、分泌胞外多糖和產(chǎn)ACC脫氨酶活性的植物根際促生細(xì)菌P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑的結(jié)果表明，各接菌處理不僅能增加紅棗植株的株高，地上、地下部干物質(zhì)的積累和葉片相對(duì)水分含量，還能提高植株的氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、胞間CO2濃度和葉綠素含量。由此說(shuō)明，P.koreensis和B. filamentosus通過(guò)提高紅棗植株對(duì)土壤水分和養(yǎng)分吸收的能力，增加葉片相對(duì)水分含量，緩解干旱脅迫，從而打開氣孔增加光合速率，同時(shí)菌株產(chǎn)生的ACC脫氨酶可分解植株體內(nèi)的脅迫乙烯，使得葉綠素不受損害，以保證紅棗幼苗相對(duì)高效的光合作用，促進(jìn)其生長(zhǎng)。

干旱脅迫過(guò)程中，植物體內(nèi)會(huì)積累大量活性氧自由基，來(lái)氧化膜脂肪酸中的不飽和鍵，形成丙二醛（MDA）[30]，對(duì)植物細(xì)胞造成損傷。隨著干旱脅迫程度的增加，植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的抗氧化酶—過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等來(lái)清除多余的活性氧自由基[31-32]。Brilli等[7]在干旱脅迫的番茄（Solanum lycopersicum）植株中接種PGPR的結(jié)果顯示，植物根際促生細(xì)菌Pseudomonas chlororaphis可通過(guò)提高葉片中SOD活性來(lái)消除MDA對(duì)番茄體細(xì)胞的影響，促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)。Sukkasem等[8]認(rèn)為，在干旱脅迫下，接種Bacillus licheniformis菌劑可通過(guò)增加擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗內(nèi)POD等抗氧化酶活性來(lái)消除體內(nèi)的MDA，從而增加根毛數(shù)和鮮質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，隨著干旱脅迫程度的加劇，尤其是在中、重度水分脅迫下，MDA含量顯著高于對(duì)照，說(shuō)明紅棗植株體內(nèi)的保護(hù)機(jī)制不足以應(yīng)對(duì)中、重度水分脅迫。但是在接種菌株P(guān). koreensis或B. filamentosus后，紅棗植株內(nèi)的POD和SOD活性均較對(duì)照增加，且MDA含量較對(duì)照顯著下降（P＜0.05）。以上生理指標(biāo)充分表明，在干旱脅迫條件下，P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑均能通過(guò)提高抗氧化酶（SOD和POD）活性來(lái)減少植株體內(nèi)活性氧自由基的積累，從而提高棗樹抗旱性，緩解干旱脅迫的危害。除此之外，脯氨酸（Pro）的積累有助于維持植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，在缺水條件下保護(hù)大分子和細(xì)胞膜組織[33]。本研究接種P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑均能誘導(dǎo)脯氨酸在紅棗葉片中的積累，這表明菌株P(guān). koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑在干旱脅迫下能穩(wěn)定植株滲透壓力，提高植株耐旱性。

IAA作為促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一種重要激素，在干旱脅迫條件下，可以通過(guò)調(diào)節(jié)根系發(fā)育和結(jié)構(gòu)，來(lái)增加根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收?；|來(lái)[34]在干旱脅迫條件下，接種PGPR對(duì)番茄生長(zhǎng)影響的研究中表明，植物根際促生細(xì)菌A25（Sphingo bacterium）可通過(guò)增加番茄植株內(nèi)IAA含量，來(lái)增強(qiáng)植株的抗旱性。這些研究表明，在干旱脅迫下，有益微生物能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，在不同干旱脅迫條件下，接種P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑均能提高紅棗葉片的IAA含量，并且植株地下部干質(zhì)量有顯著上升，這說(shuō)明植物根際促生細(xì)菌P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑能夠通過(guò)增加紅棗植株體內(nèi)IAA含量，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增加根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，從而提高棗樹的抗旱性。此外，ABA作為植物體內(nèi)積累的一種重要脅迫激素，在水分虧缺時(shí)通過(guò)控制氣孔關(guān)閉和脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來(lái)調(diào)控水分損失。水分脅迫程度越嚴(yán)重，植株體內(nèi)ABA含量越高。本研究結(jié)果表明，在不同干旱脅迫程度下，接種P. koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑均可有效降低ABA含量，這也間接地反映了在脅迫條件下，接種PGPR可以減緩植株受脅迫的程度。同時(shí)，干旱脅迫下接種各菌劑后，紅棗植株的氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、胞間CO2濃度、葉綠素含量升高，地上部干重增加，說(shuō)明在干旱條件下菌株P(guān). koreensis、B. filamentosus及其混合菌劑均能通過(guò)降低ABA含量，打開氣孔，增強(qiáng)光合作用，從而促進(jìn)紅棗植株生長(zhǎng)。

眾所周知，各菌群之間存在相互作用，它們?cè)诎l(fā)揮作用的過(guò)程中不是獨(dú)立的。余旋等[35]在不同解磷菌劑對(duì)美國(guó)山核桃（Carya illinoinensis）根際微生物和酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌、熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌這3種混合菌劑的效應(yīng)優(yōu)于單一菌劑。艾星梅等[36]在弱光下接種PGPR對(duì)重瓣百合（Lilium browniivar.viridulum）開花期光合特性及生長(zhǎng)影響的研究表明，鞘氨醇桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和黃金桿菌屬3種細(xì)菌的混合菌液接種效果最佳。本研究中，在不同干旱脅迫程度下，P. koreensis和B. filamentosus的混合菌劑接種效應(yīng)均優(yōu)于任何一種單菌劑。其原因可能是這2株菌株在混合后能夠發(fā)揮正向協(xié)同作用。一方面，可以合成或分泌一些不同于單菌株的生理活性物質(zhì)[37]，來(lái)影響植物的生理代謝，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)；另一方面，混合菌劑能夠增強(qiáng)它們?cè)诿{迫條件下的定殖能力。土壤中的菌株數(shù)量越多，分泌的生長(zhǎng)激素、ACC脫氨酶、胞外多糖等生理活性物質(zhì)越多，從而提高菌劑對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的活化能力，促進(jìn)紅棗植株對(duì)土壤水分、養(yǎng)分的吸收，緩解干旱脅迫對(duì)紅棗植株的傷害。因此，P. koreensis和B. filamentosus混合菌劑可能更有利于生物肥料的開發(fā)與應(yīng)用。但對(duì)這2株菌株在混合后發(fā)揮正向協(xié)同作用的機(jī)理有必要進(jìn)行深入研究。