蒸煮溫度對羊肉肌原纖維蛋白特性的影響

陳春梅 陸辰燕 沈銀涵 劉玥 劉瑞 于海 席軍 林廣桃

摘 要：通過測定羊肉的蒸煮損失率、pH值、色澤、質(zhì)構(gòu)、蛋白降解狀況、脂肪氧化情況及微觀結(jié)構(gòu)，研究不同蒸煮溫度（中心溫度分別為20、50、60、70、80、90 ℃）對羊肉肌原纖維蛋白特性的影響。結(jié)果表明：蒸煮損失率隨著蒸煮溫度的升高而升高，由20 ℃處理組的0.90%升至90 ℃處理組的最高值41.47%;硬度、內(nèi)聚力和咀嚼性均在80 ℃時出現(xiàn)峰值;硫代巴比妥酸反應(yīng)物值在中心溫度升高至70 ℃后呈下降趨勢;亮度值（L*）和黃度值（b*）分別在70、60 ℃時達(dá)到最大，紅度值（a*）呈下降趨勢;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜中，分子質(zhì)量36～130 kDa的蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生小分子肽;掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，隨著中心溫度的升高，肌纖維之間的間隙逐漸增大，70 ℃時最大，之后隨中心溫度的升高逐漸縮小，且造粒和崩解現(xiàn)象加劇。因此，羊肉蛋白結(jié)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)在蒸煮過程中會因蒸煮溫度變化而發(fā)生改變，從而對羊肉品質(zhì)造成影響。

關(guān)鍵詞：羊肉;溫度;嫩度;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;微觀結(jié)構(gòu)

Abstract： The effects of different cooking temperatures （internal temperatures of 20， 50， 60， 70， 80 and 90 ℃） on the properties of mutton myofibrillar proteins were studied by measuring the cooking loss rate， pH value， color， texture， protein degradation， fat oxidation and microstructure. The results showed that the cooking loss rate increased from 0.90% to 41.47% with increasing cooking temperature from 20 to 90 ℃. The hardness， cohesion and chewiness all peaked at 80 ℃. The thiobarbituric acid reactive substances （TBARs） value reached the maximum value at 70 ℃ and then decreased at higher temperatures. The brightness value （L*） and yellow value （b*） reached the maximum value at 70 and 60 ℃， respectively， while the redness value （a*） always showed a downward trend. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） showed that the proteins with molecular mass of 36–130 kDa were degraded into small peptides. The results of scanning electron microscope （SEM） showed that the gap between muscle fibers gradually increased with increasing temperature up to 70 ℃， and then decreased at higher temperatures. Moreover， the degree of phenomenon of granulation and disintegration was aggravated. Therefore， during the cooking process of mutton， its protein structure and microstructure will change due to the change of temperature， affecting the change of mutton quality.

Keywords： mutton; temperature; tenderness; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; microstructure

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200426-104

中圖分類號：TS251.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0040-06

引文格式：

陳春梅， 陸辰燕， 沈銀涵， 等. 蒸煮溫度對羊肉肌原纖維蛋白特性的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200426-104.? ? http：//www.rlyj.net.cn

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隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，羊肉消費(fèi)量顯著提高。羊肉富含水分、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)以及維生素等營養(yǎng)成分。羊肉中脂肪以及膽固醇含量顯著低于豬肉，是不飽和脂肪酸的良好來源[1]。同時羊肉的多汁性以及嫩度已成為現(xiàn)代消費(fèi)者選擇羊肉的主要原因[2]。肉在食用前通常需要煮熟，因此了解煮熟過程中肉質(zhì)的變化非常重要。烹煮羊肉的過程中，高溫促使蛋白質(zhì)變性，從而影響營養(yǎng)和口感風(fēng)味。Combes[3]、董晗[4]及王兆明[5]等研究不同蒸煮溫度下兔肉嫩度的變化發(fā)現(xiàn)，蒸煮溫度升高導(dǎo)致兔肉品質(zhì)下降。吳利芬等[6]在研究加熱溫度和水分含量對豬肉品質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，加熱溫度越高、水分含量越低，豬肉硬度越大。Roldán等[7]研究溫度對低溫真空蒸煮羊肉品質(zhì)的影響，結(jié)果表明溫度越高羊肉品質(zhì)越差，在掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像中觀察到60 ℃時結(jié)締組織造粒、70 ℃時出現(xiàn)凝膠化。目前，對羊肉的研究主要集中在風(fēng)味和貯藏品質(zhì)等[8-9]方面，而羊肉在加熱過程中所發(fā)生的一系列變化并未詳細(xì)闡明。本實驗以蘇州湖羊為研究對象，分析不同蒸煮溫度對羊肉蒸煮損失率、pH值、色澤、質(zhì)構(gòu)、蛋白降解狀況、脂肪氧化及微觀結(jié)構(gòu)的影響，旨在進(jìn)一步闡明蒸煮溫度對羊肉肌原纖維蛋白特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 月齡湖羊（公羊）后腿肉 蘇州太湖東山湖羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。

磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0） 賽默飛世爾科技公司;10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠超快速配制試劑盒?上海碧云天生物技術(shù)有限公司;體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛、0.02 mol/L硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）?上海源葉生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)染色溶液、0.1%乙二胺四乙酸（ehylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、7.5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-ZK1單孔數(shù)顯水浴鍋 南京科爾儀器設(shè)備有限公司;Ultra TurraxT25 BASIS高速勻漿機(jī) 德國IKA公司;Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司;XL-30環(huán)境掃描電子顯微鏡 荷蘭皇家飛利浦公司;TMS-PRO食品質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司;SC-80C全自動色差計 北京康光光學(xué)儀器有限公司;Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

使用前將羊后腿肉于4 ℃解凍24 h，去除可見結(jié)締組織、脂肪和筋膜，切成長×寬×高為50 mm×50 mm×20 mm的肉塊并裝入蒸煮袋中。樣品分別浸入溫度（T+2） ℃（T為中心溫度）的水浴鍋中進(jìn)行加熱，使用插入式溫度計測定肉樣中心溫度，當(dāng)肉樣中心溫度分別達(dá)到50、60、70、80、90 ℃時，立即浸入冰水中降溫至中心溫度20 ℃。每個處理組3 個平行。

1.3.2 蒸煮損失率測定

將樣品修整后使用濾紙擦干表面水分，稱質(zhì)量，然后將樣品按1.3.1節(jié)方法處理，取出處理后的樣品用濾紙擦干表面水分并記錄質(zhì)量。根據(jù)式（1）計算蒸煮損失率。

式中：m1為蒸煮前質(zhì)量/g;m2為蒸煮后質(zhì)量/g。

1.3.3 pH值測定

稱取2.0 g樣品切碎后置于裝有20 mL 4 ℃蒸餾水的50 mL離心管中，經(jīng)勻漿機(jī)高速（10 000 r/min）勻漿30 s后靜置30 min。pH計經(jīng)過調(diào)零后置于樣品中，待數(shù)值穩(wěn)定后記錄pH值。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性測定

將樣品沿肌纖維方向切成10 mm×10 mm×10 mm的小方塊，平行測定3 次。參數(shù)如下：圓柱形P/50A探頭，感應(yīng)源25 N，壓頭直徑41 mm，測試速率120 mm/min，觸發(fā)力0.8 N，壓縮比50%，停留時間5 s。

1.3.5 色澤測定

肉樣切成長×寬×高為5 cm×5 cm×1 cm的肉塊，使用色差計進(jìn)行測定。測定前使用標(biāo)準(zhǔn)白色樣品板及黑色樣品板調(diào)零，然后測定樣品紅度值（a*）、黃度值（b*）及亮度值（L*），每個樣品測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 肌原纖維蛋白的提取

參考Wu Mangang等[10]的方法并稍作修改。稱取2.0 g肉切碎放入50 mL離心管中，加入10 倍體積的4 ℃磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）勻漿2 次，每次15 s，間歇30 s，2 000×g離心20 min，棄上清液。重復(fù)上述步驟，共離心3 次。用0.1 mol/L NaCl溶液洗滌3 次，相同條件下再次離心，沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.7 肌原纖維蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析將6 mg/mL肌原纖維蛋白樣品與2×上樣緩沖液以體積比1∶1混勻，于100 ℃下水浴10 min。采用4%濃縮膠、15%分離膠，上樣量為15 μL。濃縮膠電壓90 V、電泳時間30 min，分離膠電壓120 V、電泳時間60 min。電泳結(jié)束后，取下膠使用考馬斯亮藍(lán)染色溶液進(jìn)行染色、搖床脫色，拍照成像。

1.3.8 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARs）值測定參考李夢琪等[11]的方法并稍作修改。取5.0 g肉樣切碎后置于藍(lán)帽瓶中并加入30 mL 7.5% TCA溶液（含0.1% EDTA），7 000 r/min高速勻漿2 min，雙層濾紙抽濾2 次;取5 mL濾液加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，90 ℃水浴40 min;冷卻后2 000×g離心5 min，取上清液并加入5 mL氯仿?lián)u勻，靜置后取上清液分別于532、600 nm波長處測定吸光度。結(jié)果以每千克肉樣中所含丙二醛質(zhì)量表示，TBARs值按式（2）計算。

式中：A532 nm為樣品在532 nm波長處吸光度;A600 nm為樣品在600 nm波長處吸光度;m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.9 SEM觀察肌原纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)

羊肉蒸煮后沿肌纖維方向切成長×寬×高為1 cm×1 cm×3 cm的條狀，將切好的樣品置于-196 ℃液氮中迅速冷凍。冷凍后垂直于肌纖維方向迅速切成厚5 mm的片狀，置于2.5%戊二醛溶液（由0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制）中，4 ℃下固定3 d。固定完成后使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次15 min，用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇（含無水硫酸鈉）逐級脫水，每次15 min，干燥、噴金處理。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù);采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，在0.05水平上進(jìn)行顯著檢驗（P<0.05）;使用Origin 18.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸煮溫度對羊肉蒸煮損失率的影響

加熱導(dǎo)致羊肉中水分含量降低汁液流失和體積變小。系水力是影響肉品多汁性以及嫩度的重要因素，主要通過蒸煮損失率來體現(xiàn)。蒸煮過程中羊肉汁液大量損失，并以溫度和時間為依賴因素[12]。由圖1可知，隨著中心溫度的升高，羊肉的蒸煮損失率顯著增大。中心溫度20 ℃時，羊肉的蒸煮損失率最?。?.90%），之后隨中心溫度的升高不斷增大，中心溫度90 ℃時達(dá)到最大（41.47%）。這與Vaudagna等[13]的研究結(jié)果一致，即低溫真空蒸煮過程中，牛肉的蒸煮損失率在45～80 ℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而增大，80 ℃后蒸煮損失率逐漸減小。肉品在熱處理過程中的汁液流失現(xiàn)象與肌原纖維蛋白變性有關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，溫度低于60 ℃的肉類汁液流失主要與熱變性肌漿蛋白等物質(zhì)隨自由水分流出以及膠原蛋白收縮有關(guān)[15]。溫度高于60 ℃的汁液流失一部分是由于肌動蛋白、肌球蛋白變性，另一部分是由于膠原蛋白交聯(lián)度降低形成明膠析出所致[16-17]。

2.2 蒸煮溫度對羊肉pH值的影響

由圖2可知，隨著中心溫度的升高，羊肉pH值整體呈上升趨勢。在50～60 ℃期間，pH值呈下降趨勢，隨后在60～90 ℃呈上升趨勢。pH值與肉中水分含量相關(guān)，在蒸煮過程中水分流失會帶走一部分乳酸，可能會對羊肉pH值造成影響[18]。加熱過程中羊肉pH值的增大可能是由于加熱導(dǎo)致蛋白變性引起酸性基團(tuán)減少，也可能是由于肌肉中的水分被蛋白束縛住[19-20]。50～60 ℃期間pH值下降可能與脂肪水解形成脂肪酸有關(guān)。

2.3 蒸煮溫度對羊肉質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)特性是評價肉品品質(zhì)尤其是嫩度的重要指標(biāo)[21]。硬度是肌肉保持形狀的結(jié)合力，彈性是肌肉經(jīng)外力作用后的復(fù)原能力，內(nèi)聚力是肌肉抵抗咀嚼受損保證其完整性的能力，咀嚼性則是上述三者的綜合表現(xiàn)[22]。由表1可知，羊肉硬度隨中心溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在80 ℃時達(dá)到最大（P<0.05）。羊肉彈性隨著中心溫度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢。黏附性、內(nèi)聚力、膠黏性和咀嚼性的變化趨勢和硬度相似。影響肉品質(zhì)構(gòu)特性的因素很多，但主要因素為水分含量、蛋白質(zhì)組分、肌纖維特性和溫度[12]。中心溫度低于80 ℃時，咀嚼性增大的原因可能是由于結(jié)締組織和肌原纖維蛋白變性增加了膠原蛋白含量以及縮小了肌纖維空隙[23]。當(dāng)中心溫度超過80 ℃后，結(jié)締組織降解使肌肉組織變得松散，硬度下降[23]。

2.4 蒸煮溫度對羊肉脂肪氧化的影響

TBARs值作為衡量脂質(zhì)氧化的標(biāo)準(zhǔn)之一，通過量化脂肪氧化次級產(chǎn)物丙二醛的含量來檢測肉類脂質(zhì)氧化程度[20]。由圖3可知，中心溫度低于70 ℃時，TBARs值呈上升趨勢，當(dāng)中心溫度高于70 ℃時，TBARs值呈下降趨勢。李夢琪等[11]研究表明，加熱導(dǎo)致真空低溫烹飪雞胸肉TBARs值增加，且在65～85 ℃范圍內(nèi)隨加熱溫度的升高TBARs值呈下降趨勢，這可能是由于丙二醛與羊肉中蛋白質(zhì)、氨基酸等含氨基化合物作用導(dǎo)致丙二醛含量下降。

2.5 蒸煮溫度對羊肉色澤的影響

肉色是影響消費(fèi)者食欲的重要因素，溫度會影響肉色的變化。羊肉色澤主要受肌紅蛋白的影響。由圖4可知，隨著中心溫度的上升L*整體呈上升趨勢，70 ℃時達(dá)到最大。a*整體呈下降趨勢，b*整體呈上升趨勢且在60 ℃最大。這可能是由于隨著中心溫度的升高，羊肉蛋白變性，蒸煮損失率增大，汁液流失增大，水分聚集在肉樣表面，光照反射力增強(qiáng)，L*增大[22]。隨著中心溫度的升高肌肉中氧合肌紅蛋白中Fe2+被氧化成Fe3+，形成使肉色變成褐色的高鐵肌紅蛋白，使得a*下降、b*整體上升[27]。

2.6 蒸煮溫度對肌原纖維蛋白的影響

通過SDS-PAGE圖可以觀察不同蒸煮溫度下羊肉肌原纖維蛋白的變化。由圖5可知，隨著中心溫度的升高，分子質(zhì)量36～130 kDa的部分蛋白發(fā)生降解，并產(chǎn)生了新的小分子肽。中心溫度70～90 ℃分子質(zhì)量55～72 kDa、80～90 ℃分子質(zhì)量10～17 kDa均出現(xiàn)了新的肽片段。同時，在250 kDa處出現(xiàn)蛋白條帶聚集的現(xiàn)象，這可能是由蛋白質(zhì)氧化與脂質(zhì)氧化和/或肌紅蛋白氧化結(jié)合所致[24-25]。

2.7 蒸煮溫度對羊肉微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同中心溫度對羊肉微觀結(jié)構(gòu)的影響程度不同。由圖6可知，新鮮羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊。隨著中心溫度的升高，肌纖維間隙逐漸增大，70 ℃時間隙最大，隨后間隙逐漸縮小。隨著內(nèi)部溫度升高，纖維排列緊湊主要歸因于水分流失、細(xì)胞膜破壞、纖維橫向收縮、凝膠形成以及結(jié)締組織收縮[26]。除了明顯的間隙變化外，結(jié)締組織的變化也尤為明顯。中心溫度60 ℃后，肌纖維表面出現(xiàn)顆粒物質(zhì)，可能是由肌內(nèi)膜和肌膜結(jié)構(gòu)開始破裂引起。隨著溫度升高，造粒和崩解現(xiàn)象加劇。90 ℃時顆粒填充于肌肉纖維之間和肌肉纖維束之間[28]。Roldán等[7]發(fā)現(xiàn)隨著烹飪溫度的升高和時間的延長，結(jié)締組織會發(fā)生嚴(yán)重的變性進(jìn)而形成凝膠，變性凝膠和其他微粒物質(zhì)填補(bǔ)了空隙，導(dǎo)致肌肉緊繃。Qi Jun[12]和Benjakul[29]等研究發(fā)現(xiàn)，一些殘留的不溶性膠原蛋白會擠壓熱變性肌原纖維，使肌肉纖維間隙減小，光線照射時反射光增加，導(dǎo)致肉色更加明亮，與L*結(jié)果基本相似。

3 結(jié) 論

不同蒸煮溫度下羊肉蛋白的相關(guān)特性發(fā)生了顯著變化：蒸煮損失率隨著羊肉中心溫度的升高顯著增大（P<0.05）;TBARs值、pH值、色澤、質(zhì)構(gòu)特性以及微觀結(jié)構(gòu)均隨中心溫度的增加而發(fā)生變化，造成這些變化最主要的原因可能是肌原纖維蛋白的變化。肌原纖維蛋白作為肌肉中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠通過毛細(xì)作用保持肉中水分。當(dāng)肌肉被加熱時，蛋白變性并釋放出被包裹的汁液，影響熟肉的色澤。結(jié)締組織的增溶作用和肌原纖維蛋白的熱變性共同改善了肉的嫩度。脂肪氧化產(chǎn)物可以直接或間接與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，如脂肪氧化產(chǎn)物氫過氧化物和醛類可以與賴氨酸反應(yīng)生成吡咯衍生物，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與氨基酸殘基反應(yīng)所生成的產(chǎn)物會引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。由于蛋白質(zhì)的交聯(lián)與聚集會對隨后的蛋白質(zhì)消化率產(chǎn)生負(fù)面影響，因此進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的變化將是很有意義的。

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