大鯢肌肉分離蛋白特性

楊慧 陳德經(jīng) 陳海濤 董夢堯

摘 要：為研究大鯢肌肉蛋白組成及特性，從大鯢肌肉中分離肌漿蛋白、肌原纖維蛋白及肌基質(zhì)蛋白，測定其含量、氨基酸組成、分子質(zhì)量、紫外光譜和紅外光譜，利用掃描電子顯微鏡觀察蛋白微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：肌漿蛋白含量為4.91%，分子質(zhì)量為20～200 kDa;肌原纖維蛋白含量為9.03%，主要包含肌球蛋白重鏈（200 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）和原肌球蛋白（36 kDa）;肌基質(zhì)蛋白含量為2.28%，分子質(zhì)量分布在29～40 kDa、160～200 kDa;3 種分離蛋白在280 nm波長處均有最大紫外吸收峰，肌原纖維蛋白在酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均有紅外特征吸收峰，肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白僅在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶出現(xiàn)紅外特征吸收峰。掃描電子顯微鏡圖像顯示，肌漿蛋白蛋白束平滑，肌原纖維蛋白為棒塊狀或顆粒狀聚合物，肌基質(zhì)蛋白有完整的纖維結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：大鯢;蛋白質(zhì);肌漿蛋白;肌原纖維蛋白;肌基質(zhì)蛋白

Abstract： In this paper， the composition and characteristics of giant salamander muscle proteins were studied. Sarcoplasmic， myofibrillar and muscle matrix proteins were isolated from giant salamander muscle， and their protein content， amino acid composition， molecular mass， ultraviolet （UV） spectra and infrared （IR） spectra were determined， and protein microstructures were observed by scanning electron microscope （SEM）. The results showed that the content of sarcoplasmic protein was 4.91%， with a molecular mass of 20–200 kDa; the content of myofibrillar protein was 9.03%， mainly including 200 kDa myosin heavy chain， 43 kDa actin and 36 kDa myosin; and the content of muscle matrix protein was 2.28%， with molecular mass distribution in the range of 29–40 and 160–200 kDa. All three proteins exhibited maximum UV absorption peaks at 280 nm. There were characteristic IR absorption peaks for myofibrillar protein in the amide A， B， Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ regions， while the characteristic IR absorption peaks of sarcoplasmic protein and muscle matrix protein appeared only in the amide Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ regions. The SEM images showed that the surface of sarcoplasmic protein was smooth， myofibrillar protein was a rod-shaped or granular polymer， and muscle matrix protein had a more intact fiber structure.

Keywords： giant salamander; protein; sarcoplasmic protein; myofibrillar protein; muscle matrix protein

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200515-121

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0028-05

引文格式：

楊慧， 陳德經(jīng)， 陳海濤， 等. 大鯢肌肉分離蛋白特性研究[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200515-121.? ? http：//www.rlyj.net.cn

YANG Hui， CHEN Dejing， CHEN Haitao， et al. Characteristics of proteins isolated from giant salamander muscle[J]. Meat Research， 2020， 34（7）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200515-121.? ? http：//www.rlyj.net.cn

大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，屬脊索動物門、兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科。大鯢全身是寶，肌肉、黏液、皮膚、骨頭和油脂均有較高的營養(yǎng)和藥用價值，大鯢機(jī)體中肌肉占比最高，占體質(zhì)量的50%左右?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，經(jīng)常食用大鯢可益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能、防止心腦血管、惡性貧血和惡性腫瘤等疾病[1]。大鯢肌肉必需氨基酸含量較高[2]，不飽和脂肪酸包括油酸（32.60%）、亞油酸（14.70%）、亞麻酸（6.80%）、二十碳五烯酸（3.50%）和二十二碳六烯酸（4.20%）等[3]，營養(yǎng)遠(yuǎn)高于牛肉和鹿肉。此外，大鯢肉粉還具有抗疲勞和提高免疫力的作用[4]。近年來，對大鯢的研究主要集中在大鯢養(yǎng)殖繁殖技術(shù)[5-8]、大鯢皮膚膠原蛋白[9-10]和大鯢黏液[11-12]等領(lǐng)域，目前大鯢肌肉分離蛋白特性的研究還很少，倪冬冬[13]研究了溫度對大鯢肌原纖維蛋白的影響。

蛋白質(zhì)是肌肉的主要成分，根據(jù)溶解性可將其分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白。肌漿蛋白為水溶性蛋白，與肉的呈味特性和色澤有關(guān)，還可參與細(xì)胞的代謝反應(yīng)[14]。肌原纖維蛋白為鹽溶性蛋白，與肉制品凝膠特性、肌肉彈性等密切相關(guān)[15]。肌基質(zhì)蛋白為不溶性蛋白，與肉嫩度和彈性相關(guān)[16]。分離蛋白理化及功能特性的研究可為大鯢肉烹調(diào)特性及大鯢蛋白產(chǎn)品的精深加工提供實(shí)踐指導(dǎo)作用。

本研究對大鯢肌肉蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，分析分離所得蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜、紫外光譜、紅外光譜和掃描電子顯微鏡圖像，以期為大鯢蛋白產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢肌肉 漢中龍鯢生物工程股份有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、冰乙酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、正丙醇、異丙醇、高氯酸、檸檬酸、無水乙酸鈉（均為分析純） 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;SDS、蛋白Marker、考馬斯亮藍(lán)G250、丙烯酰胺、四甲基乙二胺、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、甘氨酸、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇、甘油（均為電泳級） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器公司;LGJ-40E真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;QYKDN-C凱氏定氮儀 上海喬躍電子有限公司;Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀 大昌華嘉商業(yè)有限公司;PE28 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;DYCZ-24DN垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司;JA5003分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;TGL-20M冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Phenom臺式掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的分離提取

參考Saito[17]方法。稱取絞碎的大鯢肉糜250 g，加入4 倍體積0.05 mol/L、pH 7.5磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌輔助提取3 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀物再加入上述磷酸鹽緩沖液，重復(fù)上述操作，合并上清液即得水溶性肌漿蛋白。向沉淀中加入4 倍體積含0.6 mol/L NaCl磷酸鹽緩沖溶液，磁力攪拌輔助提取8 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，繼續(xù)加入含0.6 mol/L NaCl磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)提取、離心操作，合并上清液，即得鹽溶性肌原纖維蛋白。所得的沉淀用蒸餾水反復(fù)洗滌5 次，即得肌基質(zhì)蛋白。

蛋白除鹽：選用MD77（截留分子質(zhì)量7 000 Da）規(guī)格的透析袋進(jìn)行脫鹽，透析袋使用前用沸水煮10 min，而后分別將肌漿蛋白和肌原纖維蛋白裝入透析袋中，置于裝滿純水的大燒杯中透析（4 ℃冰箱），4 h更換1 次透析液。用1 g/100 mL AgNO3檢驗(yàn)氯離子的存在，無氯離子存在時透析結(jié)束，脫鹽所得的蛋白質(zhì)真空冷凍干燥備用。凱氏定氮法測定各分離蛋白的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 大鯢肌肉分離蛋白的氨基酸種類及含量測定

參考羅敏等[18]的方法，分別稱量大鯢肉糜、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白凍干粉0.500 g于安培瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮?dú)?0 s，重復(fù)3 次，封口，放入105 ℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，冷卻后定容至10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取出1 mL烘干，再加入200 μL蒸餾水烘干，重復(fù)3 次后，加入pH 2.2的磷酸緩沖液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后注入氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成及含量。

1.3.3 大鯢肌肉分離蛋白的SDS-PAGE分析

參考戴春陽[19]的方法。采用5%濃縮膠、15%分離膠對大鯢肌漿蛋白、肌原纖維蛋白及肌基質(zhì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白用pH 7.5磷酸鹽緩沖液溶解，肌基質(zhì)蛋白用尿素溶解。每孔蛋白Marker上樣量為5 ?L，蛋白溶液上樣量為10 ?L。設(shè)置電泳初始電壓為80 V，當(dāng)樣品前沿剛好進(jìn)入分離膠后將電壓提高到120 V，電泳時間約4 h。

1.3.4 大鯢肌肉分離蛋白的紫外光譜測定

將肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶于中性磷酸鹽緩沖液，肌基質(zhì)蛋白溶于0.5 mol/L鹽酸溶液，而后置于紫外-可見分光光度計(jì)的卡槽中，測定220～800 nm波長范圍的吸光度，波長間隔為1 nm，繪制吸光度隨波長變化的曲線圖。

1.3.5 大鯢肌肉分離蛋白的紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片法[20]：準(zhǔn)確稱取200 mg溴化鉀粉末4 份，3 份分別與1 mg透析、冷凍干燥后的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白樣品混勻，另1 份作空白對照，置于瑪瑙缽體中研成細(xì)粉后進(jìn)行壓片。使用紅外光譜儀測定4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)的透過率。

1.3.6 大鯢肌肉分離蛋白的掃描電子顯微鏡觀察

取少許肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白凍干粉末，將直徑12 mm雙面碳導(dǎo)電膠片粘貼在釘型樣品臺上，而后將樣品均勻覆蓋在膠片表面，用鑷子將釘型樣品臺夾起放于電鏡標(biāo)準(zhǔn)樣品杯中，旋轉(zhuǎn)樣品杯，動力除塵器吹幾次，除去灰塵后放置于電鏡載物臺，調(diào)節(jié)最佳視野和放大倍數(shù)對樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢肌肉的蛋白質(zhì)組成及含量

由圖1可知，大鯢肌肉中肌原纖維蛋白含量最高，為9.03%，其次是肌漿蛋白（4.91%），肌基質(zhì)蛋白含量最低，為2.28%。大鯢肌肉蛋白質(zhì)含量為17.08%，3 種蛋白占大鯢肌肉總粗蛋白的比例為肌原纖維蛋白（52.87%）>肌漿蛋白（28.75%）>肌基質(zhì)蛋白（13.35%），這與Tornberg[21]研究的動物肌肉中肌漿蛋白占總蛋白30%～35%、肌原纖維蛋白占總蛋白55%～60%的結(jié)論相似。魚類肌肉蛋白質(zhì)種類大致相同，但不同物種間蛋白質(zhì)含量差異較大。草魚肌肉中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白分別占總蛋白的24.31%、46.23%和10.19%，鯉魚肌肉中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白分別占總蛋白的22.12%、55.92%和8.54%[22]。羅非魚肉中蛋白質(zhì)含量為肌原纖維蛋白（49.48%）>肌漿蛋白（29.34%）>肌基質(zhì)蛋白（15.54%）[23]。高白鮭肌肉蛋白質(zhì)中肌原纖維蛋白占總蛋白質(zhì)的35.86%，肌漿蛋白占28.73%，肌基質(zhì)蛋白占16.27%，且3 種蛋白質(zhì)含量均隨貯藏時間的延長呈下降趨勢[24]。

2.2 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量

由表1可知，大鯢肌肉和3 種分離蛋白中均檢測出17 種氨基酸，其中包括7 種必需氨基酸（色氨酸在水解過程中被破壞，未測），肌漿蛋白、肌原纖維蛋白必需氨基酸含量豐富，其占總氨基酸含量的比例分別為41.17%、40.04%，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織理想模式推薦的必需氨基酸占總氨基酸比例為40%，是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白。肌基質(zhì)蛋白的總氨基酸含量僅為48.56 g/100 g，這可能和肌基質(zhì)蛋白在酸性溶液中溶解性較低，因而蛋白不能完全水解有關(guān)。大鯢分離蛋白的氨基酸組成與大鯢肌肉的氨基酸組成無明顯差別，含量最高的為谷氨酸，其次為天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸，這和文獻(xiàn)[25]所報道的一些淡水魚的氨基酸含量高低順序基本一致。大鯢肌原纖維蛋白的谷氨酸、賴氨酸含量明顯高于肌漿蛋白，谷氨酸殘基和賴氨酸殘基是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶作用的底物，其較高的含量有利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)揮作用，促使肌原纖維蛋白分子間谷氨酸、賴氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的交聯(lián)作用，增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高魚糜制品的凝膠強(qiáng)度[22]。肌基質(zhì)蛋白的脯氨酸含量明顯高于肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，這主要是由于肌基質(zhì)蛋白多為肌肉中不溶性結(jié)締組織，結(jié)締組織主要包含膠原蛋白和彈性蛋白，而膠原蛋白中富含脯氨酸。

2.3 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結(jié)果

SDS-PAGE圖可反映出蛋白質(zhì)之間發(fā)生的交聯(lián)、聚集及降解情況。由圖2可知，大鯢肌肉分離蛋白質(zhì)條帶清晰、雜帶較少，說明提取純度較高。大鯢肌原纖維蛋白主要有3 個條帶，其分子質(zhì)量分別為220、43、36 kDa，分別代表肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和原肌球蛋白，這與前人研究結(jié)果[26]相符。大鯢肌漿蛋白的分子質(zhì)量主要分布在20～200 kDa，28～36 kDa蛋白條帶較明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Chan等[27]的肌漿蛋白電泳圖相似。大鯢肌基質(zhì)蛋白分子質(zhì)量分布范圍較廣，29～240 kDa間均出現(xiàn)條帶，29～40 kDa、160～200 kDa條帶密集且顏色最深，可能是堿溶性蛋白和膠原蛋白[28]的特征條帶。

2.4 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的紫外光譜分析

由圖3可知，同一波長下，肌基質(zhì)蛋白的紫外吸收值最大，其次是肌漿蛋白，肌原纖維蛋白最小。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均在280 nm波長處出現(xiàn)最大吸收值。相比于其他2 種蛋白，肌基質(zhì)蛋白在220～300 nm區(qū)間內(nèi)的紫外吸收信號比較雜亂，但其在280 nm波長處也有較強(qiáng)的吸收峰，說明大鯢分離蛋白均含有色氨酸和酪氨酸。蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對紫外光的吸收，生色基團(tuán)不同，紫外吸收峰位置也不同。色氨酸在280 nm波長處有特征吸收峰，酪氨酸在275 nm附近有特征吸收峰，苯丙氨酸在257 nm附近有特征吸收峰[29]。

2.5 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的紅外光譜分析結(jié)果

由圖4可知，3 種分離蛋白出現(xiàn)若干特征吸收峰，大鯢肌原纖維蛋白在酰胺A帶（3 300 cm-1左右）、酰胺B帶（3 100 cm-1左右）、酰胺Ⅰ帶（1 660 cm-1左右）、酰胺Ⅱ帶（1 570 cm-1左右）和酰胺Ⅲ帶（1 350 cm-1左右）均有特征吸收峰出現(xiàn)，這與大黃魚肌原纖維蛋白譜帶[30]較為一致。肌漿蛋白、肌基質(zhì)蛋白的紅外圖譜較相似，其在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均有特征吸收峰。與肌原纖維蛋白不同的是，肌漿蛋白、肌基質(zhì)蛋白在酰胺A、B帶未出現(xiàn)紅外特征吸收峰。酰胺鍵通常是表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的特征官能團(tuán)，酰胺A帶主要由N-H的伸縮振動引起，酰胺B帶由-CH2不對稱伸縮振動引起，酰胺Ⅰ帶由C=O伸縮振動引起，酰胺Ⅱ帶由C-N伸縮振動及N-H彎曲振動引起，酰胺Ⅲ帶由N-H變形振動引起[31]。

2.6 大鯢肌肉蛋白質(zhì)的掃描電子顯微鏡圖分析

由圖5可知，大鯢肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白在微觀結(jié)構(gòu)上存在明顯區(qū)別。肌漿蛋白表面光滑、形態(tài)規(guī)則，蛋白束平滑，聚合緊密;肌原纖維蛋白內(nèi)部有很多棒塊狀或顆粒狀聚合物，聚合物不平整、無規(guī)則排列，形成細(xì)致、緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);肌基質(zhì)蛋白主要為結(jié)締組織，具有較完整的纖維結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

大鯢肌肉中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白含量分別為4.91%、9.03%、2.28%。肌漿蛋白、肌原纖維蛋白必需氨基酸含量豐富，其占總氨基酸含量的比例分別為41.17%、40.04%，肌基質(zhì)蛋白因含膠原蛋白，脯氨酸含量明顯高于肌漿蛋白和肌原纖維蛋白。大鯢肌原纖維蛋白主要由原肌球蛋白（36 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）和肌球蛋白重鏈（200 kDa）組成，肌漿蛋白分子質(zhì)量主要分布在20～200 kDa，肌基質(zhì)蛋白分子質(zhì)量分布在29～40 kDa、160～200 kDa。3 種分離蛋白在280 nm波長處均有最大紫外吸收峰出現(xiàn)，肌原纖維蛋白在酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均有紅外特征吸收峰，但肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白的紅外特征吸收峰僅在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶出現(xiàn)。掃描電子顯微鏡圖像顯示，大鯢肌肉肌漿蛋白蛋白束平滑，聚合緊密，肌原纖維蛋白內(nèi)部有很多棒塊狀或顆粒狀聚合物，聚合物無序排列，肌基質(zhì)蛋白有較完整的纖維結(jié)構(gòu)。

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