綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株三期幼蟲(chóng)P-gps基因表達(dá)分析

王鵬龍 羅曉平，2 劉 陽(yáng) 方變變 杜 勤 滕柏檜 李軍燕 楊曉野*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，呼和浩特 010031)

細(xì)頸線蟲(chóng)(Nematodirus)是綿羊胃腸道線蟲(chóng)常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)之一，在長(zhǎng)期采用化學(xué)藥物防治胃腸道線蟲(chóng)病的過(guò)程中，某些蟲(chóng)株會(huì)對(duì)驅(qū)蟲(chóng)藥物產(chǎn)生一定耐藥性。Oliver等[1]對(duì)新西蘭21個(gè)羊場(chǎng)中扁刺細(xì)頸線蟲(chóng)(Nematodirusspathiger)和尖刺細(xì)頸線蟲(chóng)(Nematodirusfilicollis)耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有11 個(gè)羊場(chǎng)的羊群感染細(xì)頸線蟲(chóng)且對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性，有10 個(gè)羊場(chǎng)疑似產(chǎn)生耐藥性，僅有1 個(gè)羊場(chǎng)分離的細(xì)頸線蟲(chóng)蟲(chóng)株對(duì)該藥物敏感。據(jù)額葉勒德格等[2]報(bào)道,內(nèi)蒙古烏審旗地區(qū)放牧綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)對(duì)伊維菌素產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，糞便蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)減少試驗(yàn)顯示，用藥后細(xì)頸線蟲(chóng)蟲(chóng)卵平均減少率不到10%，蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)陰率為0。Han等[3]報(bào)道內(nèi)蒙古東部地區(qū)10 個(gè)放牧羊群胃腸道線蟲(chóng)耐藥性調(diào)查，細(xì)頸線蟲(chóng)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)伊維菌素、阿苯達(dá)唑均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。李輝明[4]對(duì)青海省同仁縣牦牛胃腸道線蟲(chóng)耐藥調(diào)查顯示，該地區(qū)細(xì)頸線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生了耐藥性?？梢?jiàn)細(xì)頸線蟲(chóng)在某些地區(qū)對(duì)常用驅(qū)蟲(chóng)藥物已產(chǎn)生耐藥性。

目前，驅(qū)蟲(chóng)藥耐藥機(jī)制大致可分為兩大類，其一是特異性機(jī)制，即藥物結(jié)合蟲(chóng)體的靶位發(fā)生改變，從而導(dǎo)致藥物對(duì)蟲(chóng)體無(wú)效[5]。其二是非特異性機(jī)制，即蟲(chóng)體在解毒過(guò)程中，多種特異性酶活性的增加以及細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加使得藥物外排[6]。隨著多重耐藥性的出現(xiàn)，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加一直是近十年以來(lái)的研究目標(biāo)。在非特異性機(jī)制膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究中，已有資料顯示，在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中，外輸泵P-gps和多藥耐藥蛋白 MRP(Multi-drug resistance protein,MRP)是主要的膜蛋白外排通道。其中 P-gps 主要調(diào)控伊維菌素在宿主體內(nèi)吸收、分布和消除[7]。據(jù)報(bào)道，某些胃腸道線蟲(chóng)出現(xiàn)耐藥性與P-gps基因過(guò)表達(dá)有關(guān)。比如，腫孔古柏線蟲(chóng)(Cooperiaoncophora)在體內(nèi)接觸大環(huán)內(nèi)酯類藥物后，P-gps基因表達(dá)明顯上調(diào)[8]。Raza 等[6]用伊維菌素治療宿主后，其捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株P(guān)-gp-2基因表達(dá)增加。但是，到目前為止，尚無(wú)關(guān)于綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相關(guān)研究。因此，本研究擬以不同濃度的伊維菌素作用耐伊維菌素奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)(Nematodirusoiratianus)三期幼蟲(chóng)，以RT-qPCR檢測(cè)耐伊維菌素細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)P-gps基因的表達(dá)情況，旨在為研究奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)耐藥機(jī)理以及分子檢測(cè)耐藥性方法的建立提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

耐伊維菌素奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)(N.oiratianus)蟲(chóng)株于2018 年4—6 月在內(nèi)蒙古烏審旗地區(qū)自養(yǎng)自繁的羊群中分離。該羊群在近5 年一直使用伊維菌素驅(qū)蟲(chóng)，每年驅(qū)蟲(chóng)2～3 次。本研究室分離得到該蟲(chóng)株并建立實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物感染模型后，使用伊維菌素2 倍劑量驅(qū)蟲(chóng)時(shí)，糞便蟲(chóng)卵減少率為0。該蟲(chóng)株現(xiàn)保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

連續(xù)收集單獨(dú)感染有奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)的綿羊糞便，在厭氧和常溫條件下運(yùn)輸至本研究室。采用飽和鹽水漂浮法和篩網(wǎng)攔截法，收集大量細(xì)頸線蟲(chóng)蟲(chóng)卵，置于玻璃平皿，在蒸餾水中27 ℃培養(yǎng)15 d，收集三期幼蟲(chóng)，10 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 三期幼蟲(chóng)處理

取約135 萬(wàn)條三期幼蟲(chóng)，用無(wú)菌無(wú)酶水洗滌3 次，均分為3 組。其中試驗(yàn)組分別用低濃度伊維菌素(3.90 μg/mL)(前期幼蟲(chóng)移行抑制試驗(yàn)表明，該濃度作用后幼蟲(chóng)遷移率達(dá)85%)和高濃度伊維菌素(19.98 μg/mL)(前期幼蟲(chóng)移行抑制試驗(yàn)表明，該濃度作用后幼蟲(chóng)遷移率達(dá)50%)作用三期幼蟲(chóng)；對(duì)照組采用0.5% DMSO作用三期幼蟲(chóng)；在0、3、6、12 和24 h，分別提取各組三期幼蟲(chóng)總RNA,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 次重復(fù)。

1.3 引物合成

參照文獻(xiàn)已報(bào)道P-gps基因和Actin基因(內(nèi)參基因)的引物序列，由上海華大有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所需的引物信息Table 1 Primer required for the experiment

1.4 RNA提取與cDNA合成

參照文獻(xiàn)[10]提取線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)總RNA，采用超微量分光光度儀，檢測(cè)總RNA的純度和濃度，OD260/OD280作為RNA 純度的指標(biāo)[12]。按照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)，對(duì)檢測(cè)合格的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，Actin為內(nèi)參基因，按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ (TLi RNaseH Plus)說(shuō)明，每個(gè)樣品的每對(duì)引物做3 個(gè)重復(fù)。采用CFX Connect 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，并添加溶解段以確定反應(yīng)特異性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法，計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量F[13]，其數(shù)據(jù)用Excel整理，采用GraphPad Prism 6.01作圖，并進(jìn)行差異顯著性分析。基因相對(duì)表達(dá)量F計(jì)算公式如下：

F=2-{[待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值]

2 結(jié)果與分析

2.1 P-gps基因引物特異性分析

P-gps基因(除P-gp-1基因)的擴(kuò)增曲線呈“S”型、基線平直、走勢(shì)正常，Ct值在15～30且重復(fù)性較好。P-gps基因(除P-gp-1基因)的溶解曲線皆表現(xiàn)為單峰且Tm值單一。由此說(shuō)明，引物的特異性好，反應(yīng)體系穩(wěn)定，反應(yīng)程序合適，得出的數(shù)據(jù)較為可靠[12]。

2.2 低濃度伊維菌素作用三期幼蟲(chóng)后P-gps基因的表達(dá)分析

低濃度伊維菌素作用奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)，P-gps基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1(a～f)。與對(duì)照組相比，在藥物作用0 h，P-gps基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)明顯變化；在藥物作用3、6、12和24 h時(shí)，P-gp-1基因均不表達(dá)；P-gp-12基因在各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)；P-gp-9.1基因在3、6和12 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量分別顯著上調(diào)了4.71、4.35和3.28倍(P<0.05)；但在24 h時(shí)，其表達(dá)量下調(diào)；藥物作用3和6 h時(shí)，P-gp-2、P-gp-3和P-gp-11基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，12 h時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)達(dá)峰值，其表達(dá)量分別是3.77、2.2和8.3倍，而24 h時(shí)基因表達(dá)量下調(diào)。表明對(duì)該耐藥蟲(chóng)株而言，低濃度藥物作用也可能誘導(dǎo)P-gp-2、P-gp-3、P-gp-9.1和P-gp-11基因在不同時(shí)間點(diǎn)過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)或耐藥機(jī)制的發(fā)生。

*P<0.05；**P<0.01；*** P<0.001。下同。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.The same below.圖1 低濃度藥物作用幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)的 P-gps基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of P-gps gene at different time points of larvae exposed to low concentration drugs

2.3 高濃度伊維菌素作用三期幼蟲(chóng)后P-gps基因的表達(dá)分析

高濃度伊維菌素作用奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)，P-gps基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2(a～f)。與對(duì)照組相比，在藥物作用0 h時(shí)，P-gps基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)明顯變化。在藥物分別作用3、6、12和 24 h 時(shí)，P-gp-1基因均不表達(dá)；在3 和6 h時(shí)，P-gp-2基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，在12 h時(shí)，其表達(dá)量極顯著增加了4.46 倍(P<0.001)；同樣，P-gp-9.1基因在3和6 h時(shí)，表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，在12 h時(shí)表達(dá)量極顯著增加了8.29倍(P<0.001)，但是在24 h時(shí)，該基因仍然是過(guò)表達(dá)；P-gp-3基因在藥物作用3 h時(shí)，表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.001)，而后逐漸上調(diào)，于12 h達(dá)峰值；P-gp-11基因隨著藥物作用時(shí)間的增加，其表達(dá)量逐漸增加，至12 h達(dá)峰值，但在24 h時(shí)，其表達(dá)量仍然顯著增加了3.06 倍；P-gp-12基因在3 h時(shí)，其表達(dá)量下調(diào)，之后逐漸增加，在24 h達(dá)最大值，顯著增加2.73 倍(P<0.05)。表明隨著藥物濃度增大，P-gp-12基因也發(fā)生過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明耐藥機(jī)制的發(fā)生與藥物濃度密切相關(guān)。

圖2 高濃度藥物作用幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)的 P-gps基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of P-gps gene at different time points of larvae exposed to high concentration drugs

3 討論與小結(jié)

家畜胃腸道線蟲(chóng)對(duì)伊維菌素敏感性下降，與寄生線蟲(chóng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的變化密切相關(guān)[14-16]。但是，到目前為止，尚無(wú)關(guān)于綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相關(guān)研究。本研究采用熒光定量PCR，分析高低濃度伊維菌素作用綿羊奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)(N.oiratianus)三期幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)的P-gps基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，高低濃度的伊維菌素作用綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)前后，與對(duì)照組相比，隨著作用時(shí)間的增加，P-gp-2、P-gp-3、P-gp-9.1、P-gp-11和P-gp-12基因表達(dá)出現(xiàn)明顯差異。而P-gp-1基因均不表達(dá)。但是，據(jù)Lespine等[17]報(bào)道，利用秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)P-gps基因，通過(guò)相對(duì)熒光定量PCR方法，檢測(cè)未用藥物作用的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)耐伊維菌素蟲(chóng)株P(guān)-gps基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)包括P-gp-1基因在內(nèi)的11 個(gè)P-gps基因完全可以表達(dá)，且P-gp-2、P-gp-9、P-gp-11基因表達(dá)量顯著高于伊維菌素敏感株。這一現(xiàn)象可能由不同屬線蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生機(jī)理略有不同導(dǎo)致，也可能是由于在該試驗(yàn)條件下，藥物作用仍然沒(méi)有達(dá)到細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)P-gp-1基因表達(dá)的閾值。Dicker等[18]研究表明，在環(huán)紋背帶線蟲(chóng)(Teladorsagiacircumcincta)伊維菌素敏感株和耐藥株的各個(gè)生活階段，P-gp-9基因在耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于敏感株；雖然P-gp-1基因有所表達(dá)，但是耐藥株與敏感株之間并無(wú)顯著差異[18]。Drogemuller等[19]報(bào)道馬盅口線蟲(chóng)(Cyathostomins)耐丙硫咪唑的成蟲(chóng)至少有2 個(gè)P-gps基因表達(dá)。另外，Williamson等[15]研究發(fā)現(xiàn)耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)P-gp-2和P-gp-9基因均過(guò)表達(dá)，但是P-gp-1基因表達(dá)量下降。然而，上述研究均未有敏感蟲(chóng)株過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，盡管不同的寄生蟲(chóng)P-gps基因轉(zhuǎn)錄水平各不相同，且在敏感株與耐藥株之間表達(dá)水平各有差異，甚至同一種不同地區(qū)的敏感株與耐藥株的P-gps基因表達(dá)也有所差異，但是耐藥株P(guān)-gps基因過(guò)表達(dá)，而敏感株P(guān)-gps無(wú)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象卻相當(dāng)一致。因此，在以P-gps基因?yàn)榛A(chǔ)，研究寄生蟲(chóng)耐藥機(jī)理時(shí)，在種的水平上單獨(dú)研究耐藥相關(guān)基因是很有必要的，而不能一概而論。

另外，Raza等[20]報(bào)道，0.2 μg/mL伊維菌素作用耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株三期幼蟲(chóng)后3 h，有5 個(gè)P-gps基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。其中P-gp-2基因轉(zhuǎn)錄水平增加9.1 倍；P-gp-9.1、P-gp-11基因轉(zhuǎn)錄水平均增加6.4 倍。Peachey等研究發(fā)現(xiàn)，0.068 4 μmol/L(0.056 μg/mL)伊維菌素作用馬盅口線蟲(chóng)后3 h，P-gp-9.1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增加[21]。10-8mol/L(0.009 μg/mL)和10-7mol/L(0.09 μg/mL)伊維菌素作用于敏感株和耐藥株腫孔古柏線蟲(chóng)(Cooperiaoncophora)三期幼蟲(chóng)24 h后，耐藥株三期幼蟲(chóng)P-gp-1和P-gp-11基因表達(dá)水平顯著上調(diào)；然而敏感株古柏線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)并不表達(dá)[22]。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著伊維菌素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，P-gp-2、P-gp-3和P-gp-11基因表達(dá)量于12 h顯著增加，說(shuō)明耐伊維菌素蟲(chóng)株在藥物壓力的選擇下，P-gps基因過(guò)表達(dá)現(xiàn)象普遍存在。進(jìn)而表明P-gps作為一種疏水性細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，完全有可能作為外排泵將伊維菌素藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，因而寄生蟲(chóng)表現(xiàn)出耐藥表型。但是，與Raza等[20]和Peachey等[21]的報(bào)道相比，本研究中低濃度伊維菌素濃度也達(dá) 3.9 μg/mL，且藥物作用12 h時(shí)，部分基因表達(dá)量才開(kāi)始顯著增加，這可能與不同蟲(chóng)株耐伊維菌素的程度不同有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)綿羊奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)(Nematodirusoiratianus)耐伊維菌素三期幼蟲(chóng)受高低濃度的伊維菌素作用后，P-gp-2、P-gp-3、P-gp-9.1和P-gp-11基因在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度過(guò)表達(dá)，但P-gp-1均不表達(dá)；不同濃度伊維菌素作用綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)后12 h時(shí)，P-gp-2、P-gp-3和P-gp-11基因表達(dá)量均達(dá)峰值。因此，本研究在了解綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株三期幼蟲(chóng)P-gps基因表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步篩選綿羊細(xì)頸線蟲(chóng)耐伊維菌素蟲(chóng)株分子標(biāo)記提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

胃腸道線蟲(chóng)耐藥性是多基因共同決定的，其耐藥機(jī)制非常復(fù)雜。因此，不僅需要先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，而且獲得理想的試驗(yàn)樣品也很重要。遺憾的是，本研究中未分離到奧麗春細(xì)頸線蟲(chóng)伊維菌素敏感株，若后續(xù)條件允許，以敏感株為對(duì)照，研究該耐藥株P(guān)-gps基因在不同寄生階段，不同藥物濃度作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，并采用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等測(cè)序技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證P-gps基因的基礎(chǔ)上繼續(xù)挖掘新的耐藥基因，為篩選耐藥標(biāo)記基因奠定基礎(chǔ)。