基因傳輸載體綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

程 度， 李曉霞， 喬立紅

（中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510275）

0 引 言

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基因組測序、生物信息學(xué)以及基因編輯等新技術(shù)和新策略不斷涌現(xiàn)，這些技術(shù)極大推進(jìn)基因治療等技術(shù)的發(fā)展，為腫瘤等重大疾病以及眾多遺傳病的治療提供了有效手段。目前，向細(xì)胞內(nèi)傳輸核酸分子的載體材料主要有病毒載體和非病毒載體兩大類。雖然病毒載體具有傳輸效率高的優(yōu)點(diǎn)，但其較強(qiáng)免疫原性也限制了其臨床應(yīng)用。基于高分子材料的基因傳輸載體因其功能多樣性、無免疫原性和基因傳輸效率高的特點(diǎn)，在臨床基因治療方面展示出很好的應(yīng)用前景。

經(jīng)過近20 年的發(fā)展，根據(jù)臨床的需求，高分子材料基因傳輸載體發(fā)展出了多種類型的載體材料，不僅滿足了低毒性和生物可降解的臨床需求［1-2］，也發(fā)展出具有體內(nèi)長循環(huán)、生理微環(huán)境（如pH、還原性、酶）響應(yīng)性、診療一體化等功能多樣的基因輸送載體［3-6］。而且，隨著生物材料學(xué)科的發(fā)展，新的基因輸送新技術(shù)和載體會不斷涌現(xiàn)，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來新的變革。為了使學(xué)生對基因載體的設(shè)計(jì)、材料制備方法、納米粒子組裝及其生物功能評價(jià)有較為全面的認(rèn)知和掌握，本文選擇經(jīng)典的高分子基因載體材料-聚乙二醇-聚乙烯亞胺設(shè)計(jì)綜合實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI，Mn＝25 kDa），聚乙二醇單甲醚（mPEG-OH，Mn＝2 kDa），溴化氫的醋酸溶液（33%），對甲苯磺酰氯（p-toluenesulfonyl chloride， TsCl ）， N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（N-Ethyl-N′-（3-dimethylaminopropyl ） carbodiimide hydrochloride，EDC），二甲基亞砜（DMSO），均為分析純，購于Sigma-Aldrich（St． Louis，MO，USA）；其他化學(xué)試劑均購于廣州化學(xué)試劑廠，用時(shí)根據(jù)需要經(jīng)過干燥純化處理或直接使用。透析袋（MWCO：1，3． 5，14 kDa），購于上海綠鳥生物科技公司。MTT 檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用胰蛋白酶和胎牛血清（FBS）購自美國Invitrogen 公司（Carlsbad，CA，USA）；人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，由本教學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存保存。表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA（pDNA）pcDNA3． 1-EGFP購自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

氫譜1H-NMR：采用VARIAN Mercury-Plus 300 型核磁共振儀進(jìn)行分析，使用CDCl3作為溶劑。凝膠電泳裝置：EPS-100 電源、HE-120 電泳槽和Tanon-1600成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。粒徑和表面電位測定：使用BI-200 SM 動態(tài)光散射系統(tǒng)（Brookhaven Instruments，Holtsville，NY），在25 ℃下檢測。散射光以90°檢測，自動加速器上收集。倒置熒光顯微顯微鏡采用徠卡DMi8 （Leica Microsystems Inc．，Buffalo Grove，IL 60089 United States）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱采用377 型號（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。

1.3 單甲醚聚乙二醇-聚乙烯亞胺（PEG2k ～PEI25k）聚合物的制備

（1）用N，N-羰基二咪唑（CDI）活化單甲醚聚乙二醇（mPEG2k-OH），反應(yīng)路線如圖1 所示。mPEG2k-OH（4． 0 g）加入到250 mL圓底燒瓶瓶中，70℃條件下真空干燥4 h，加入30 mL四氫呋喃溶解mPEG2k-OH，再后加入3． 2 g （10eq．）的CDI，在氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)24 h后，加入無水乙醚沉淀產(chǎn)物，減壓過濾得到沉淀，干燥得白色粉末狀產(chǎn)物，產(chǎn)率89%。

圖1 PEG-CDI的合成路線

（2）mPEG2k-CDI和PEI25k上的氨基反應(yīng)制備陽離子兩嵌段聚合物PEG2k-PEI25k，反應(yīng)路線如圖2 所示。在50 mL圓底燒瓶中用二甲基亞砜（DMSO，20 mL）溶解PEI25k聚合物（1 g），再加入上步制備的mPEG2k-CDI 800 mg （10 eq．），室溫下攪拌反應(yīng)過夜。所得溶液在純水中透析48 h，每4 h換一次蒸餾水，透析袋規(guī)格為：MWCO ＝14 kDa。冷凍干燥后得白色產(chǎn)物，產(chǎn)率83%。

圖2 陽離子聚合物PEG2k-PEI25k的合成路線圖

1.4 負(fù)載pDNA納米載體的制備

本綜合實(shí)驗(yàn)所使用的pDNA為表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pcDNA3． 1-EGFP，由綜合實(shí)驗(yàn)室提前制備。質(zhì)粒DNA 溶于TE 緩沖液中，濃度為1 g ／ L。一定量pDNA（如1 μg）加入到已知量的載體聚合物PEG2k-PEI25k的溶液中，按照陽離子聚合物中氨基與pDNA磷酸根的摩爾比（N／ P）為0、0． 5、1、2、4、8、10、20 的條件，將聚合物和pDNA相混合，加入去離子水定容到一定體積，充分混勻后，室溫下振蕩孵育30 min，再靜置10 min，即得不同N／ P條件下載pDNA的納米粒子。

1.5 納米粒子理化性能的評價(jià)

（1）粒徑電位的測定。按照1． 4 中的方法制備負(fù)載pDNA的納米粒子，用動態(tài)光散射系統(tǒng)測定N／ P ＝10 時(shí)納米粒子的粒徑和Zeta 電位。溫度25 ℃，入射角45°。每組樣品均取5 次測量的平均值。

（2）聚合物PEG-PEI 復(fù)合pDNA 的能力。按照1． 4 中的條件，在不同N／ P 下，將聚合物PEG-PEI 和pDNA充分混勻，將混合溶液加入到含GoldView（DNA染料）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中進(jìn)行電泳分析，100 V的電壓下電泳20 ～30 min，電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中電泳條帶。

1.6 基因輸送性能的評價(jià)

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI 1640 培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%雙抗）的，培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時(shí)，用胰酶（Trysin，0． 25%）消化細(xì)胞，進(jìn)行分瓶傳代。

（2）細(xì)胞毒性評價(jià)。通過四唑鹽比色法（MTT）檢測納米載pDNA納米粒子對細(xì)胞的殺傷作用。細(xì)胞以1 × 103／孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。次日，棄去原有細(xì)胞培養(yǎng)基，更換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基，加入不同N／ P 條件下制備的載pDNA 納米粒子。進(jìn)行MTT分析時(shí)，棄去原有培養(yǎng)基，加入150 μL不含血清的RPMI 1640 新鮮培養(yǎng)基，加入50 μL MTT溶液（5 mg ／ mL），在37 ℃下繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)孔中的上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（美國國騰）檢測OD570nm處的吸光度值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

（3）基因表達(dá)效率評價(jià)。將細(xì)胞（密度為1 × 104細(xì)胞／孔）接種于24 孔培養(yǎng)板上，加入400 μL 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。次日，更換為新鮮培養(yǎng)基，加入不同N／ P比下制備的載質(zhì)粒DNA 的納米粒子，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物材料的制備與表征

將末端羥基PEG接枝到PEI上，需要對PEG上的羥基進(jìn)行活化。根據(jù)綜合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況和需求，采用一種步驟較少和易于操作的方法活化PEG 上的羥基。如圖3（a）所示，首先用CDI 活化PEG，其中化學(xué)位移的歸屬如下：δ ＝ 3． 4 （s，3H， CH3—OCH2CH2—），3． 65（s，4H，—OCH2CH2—），4． 6（m，2H—OCH2CH2—O（C ＝O）—，7． 05（s，1H，—CO—NCH ＝CH—N—），7． 40（s，1H，—CO—N—CH ＝CH—N—），8． 12（s，1H，—CO—N—CH ＝N—）。由δ 3． 4 μm 及δ 7． 40 μm 兩處化學(xué)位移的積分面積算出端基轉(zhuǎn)化率為81%。然后再把PEG-CDI 偶聯(lián)到PEI上，如圖3（b）所示，在δ 2． 5 ～3． 5 μm 處出現(xiàn)了PEI上—CH2CH2NH—的質(zhì)子特征化學(xué)位移，同時(shí)δ 4． 4 μm，δ 7． 05 μm ，δ 7． 40 μm ，δ 8． 12 μm等處的化學(xué)位移消失，表明PEG-CDI 已經(jīng)成功地連接到PEI 上，其中的咪唑基團(tuán)已經(jīng)被作為副產(chǎn)物除掉。

圖3 聚合物mPEG2k-CDI（a）和PEG2k-PEI25k（b）的1H-NMR圖譜（CDCls，300 MHz）

2.2 納米粒子的組裝

PEI聚合物具有枝化結(jié)構(gòu)，攜帶有伯胺、腫胺和叔胺（圖4（a）），在pH 7． 4 條件下，部分胺基可質(zhì)子化，攜帶較強(qiáng)的正電荷，通過靜電相互作用與攜帶負(fù)電荷的pDNA組裝形成納米粒。根據(jù)不同狀態(tài)pDNA在電場下泳動速度和距離的不同，可用凝膠阻滯方法評價(jià)PEG-PEI復(fù)合pDNA 的能力（圖4（b））。在N／ P≤4時(shí)，PEG-PEI 量相對較少，部分pDNA 仍處于游離狀態(tài)，形成較窄的DNA電泳條帶。隨著N／ P 的提高，游離pDNA條帶亮度逐漸降低直至消失，而彌散DNA帶型則呈逐漸增加而后消失的現(xiàn)象。其原因在于：隨著PEG-PEI含量的增加，PEI 的正電荷逐步中和pDNA的負(fù)電荷，使游離的pDNA減少；當(dāng)PEG-PEI量仍不足以完全復(fù)合pDNA 時(shí)，納米粒子上的pDNA 未被完全中和，形成攜帶不同負(fù)電荷的納米粒子，從而導(dǎo)致pDNA在凝膠上呈現(xiàn)出彌散的帶型；在N／ P ≥8 時(shí)，pDNA帶型完全消失，表明pDNA 的負(fù)電荷已被完全中和，pDNA在電場下的泳動被阻滯。

圖4 （a）PEI結(jié)構(gòu)式；（b）不同N／ P比下所制備納米粒子的凝膠阻滯電泳；（c）不同N／ P條件下，所制備納米粒子的粒徑和表面電位；（d）MTT法評價(jià)不同N／ P下所制備納米粒子的細(xì)胞毒性

但是凝膠阻滯并不能對所形成的納米粒子的表面電位和粒徑給予定量表征，而這些是影響納米粒子轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率的重要因素。因此，需要進(jìn)一步通過動態(tài)光散射對PEG-PEI和pDNA所形成納米粒子的表面電位和粒徑進(jìn)行表征。如圖4（c）所示，在N／ P ＝0． 5時(shí)，表面電位和粒徑分別為- 23 mV 和313 nm，表明pDNA未被完全復(fù)合和壓縮，導(dǎo)致粒徑偏大和電位偏負(fù)；隨著N／ P 增加到4，納米粒子負(fù)電位減小直至為0，粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢；當(dāng)N／ P ＞4 時(shí)，納米粒子表面電位的正電性逐漸增加，而粒徑逐漸減?。辉贜／ P 在10 ～20 時(shí)，納米粒子表面電位和粒徑則穩(wěn)定在+ 10 mV和125 nm左右。

由此可見，當(dāng)PEG-PEI 剛好完全中和pDNA 的負(fù)電荷時(shí)，并沒有很好地壓縮pDNA，未形成較為致密和穩(wěn)定的納米粒子；高N／ P 下，納米粒子具有較強(qiáng)的正電位和較小的粒徑，有利于提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。但是，較高正電荷會導(dǎo)致明顯的細(xì)胞陽離子毒性。因此，需要選擇合適N／ P，合理調(diào)控納米粒子的表面電位和粒徑，才能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 基因載體的安全性初步評價(jià)

MTT方法是一種簡單實(shí)用的評價(jià)聚合物細(xì)胞安全性的方法，在材料的安全性評價(jià)中得到廣泛的應(yīng)用。如圖4（d）所示，當(dāng)N／ P ＜2 時(shí)，細(xì)胞存活率大于90%，與對照組沒有顯著差異，當(dāng)N／ P ＞10 時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸下降，N／ P ＝20 時(shí)，細(xì)胞存活率低于50%。

因此，綜合考慮表面電位、粒徑以及細(xì)胞毒性等數(shù)據(jù)，在N／ P ＝8 時(shí)制備的納米粒子，具有較為適宜的電位、較小的粒徑和較低的細(xì)胞毒性，是較為適宜的載基因納米粒子制備條件。

2.4 基因轉(zhuǎn)染效率的評價(jià)

考察不同特性納米粒子對轉(zhuǎn)染效率的影響。如圖5 所示，用N／ P ＝8 條件下所制備納米粒子轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量最多，而且綠色熒光強(qiáng)度最高；在N／ P ＝0． 5 條件下，所制備納米粒子為負(fù)表面電性和較大的粒徑，導(dǎo)致其基因轉(zhuǎn)染效率降低，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量最少；當(dāng)N／ P ＝20 時(shí)，所制備納米粒子轉(zhuǎn)染細(xì)胞，雖然表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞百分比也較高，但是存活的細(xì)胞數(shù)量明顯降低，這表明納米粒子具有較高的細(xì)胞毒性。

3 討 論

PEI的結(jié)構(gòu)單元（—CH2CH2NH2—）含有一個(gè)可質(zhì)子化的氮原子，正電性氨基可有效復(fù)合和壓縮質(zhì)粒DNA，而且仲氨和叔氨在酸性條件下的質(zhì)子海綿效應(yīng)發(fā)揮破溶酶體的作用，這些因素協(xié)同提高了PEI 轉(zhuǎn)染基因的效率。但是，PEI 強(qiáng)正電荷具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和吸附血液或細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的下降［7-8］。PEG是一種無毒和低免疫原性的水溶性聚合物，具有優(yōu)良的生物相容性，在藥物改性方面有廣泛的應(yīng)用［9］，PEG修飾可降低PEI的細(xì)胞毒性和減少蛋白在其表面的沉積。在PEG修飾改性技術(shù)中，采用具有琥珀酰亞胺酯端基、環(huán)氧化物端基或醛基端基的活性PEG 修飾PEI 是行之有效的方法［10-11］。但是這些具有特異性端基活性PEG的制備復(fù)雜且價(jià)格昂貴，限制了其在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。端羥基PEG 來源廣泛且價(jià)格較低，是較為理想的供學(xué)生實(shí)驗(yàn)使用PEG修飾劑。但是羥基的反應(yīng)活性較低，需要對其進(jìn)行活化。已有多種文獻(xiàn)報(bào)道了活化端羥基PEG的方法，如通過丁二酸酐或馬來酸酐與羥基反應(yīng)引入羧基，再用DCC ／ NHS活化羧基，再和PEI上的氨基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，從而將PEG接枝到PEI［12］。但是該方法操作步驟較多，不利于本科生實(shí)驗(yàn)的開展。二異氰酸酯也可作為端羥基PEG 的活化劑［13］，但要經(jīng)過多次純化去除干凈二異氰酸酯，才能避免殘余二異氰酸酯和PEI 的副反應(yīng)，也增加了實(shí)驗(yàn)操作步驟和難度。

圖5 制備納米粒子的粒徑及其分布及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光顯微成像（細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后發(fā)藍(lán)色熒光，GFP蛋白發(fā)綠色熒光。圖（d）中的標(biāo)尺為50 μm）

N，N-碳酰二咪唑（CDI）是一種羧酸活化和甲?；D(zhuǎn)移的試劑［14］，具有反應(yīng)活性高、反應(yīng)后處理簡單和易得廉價(jià)的特點(diǎn)，常用來合成酰胺類聚合物。與EDC和DCC等同類試劑相比，CDI在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中具有更高的應(yīng)用價(jià)值。由于咪唑基團(tuán)的影響，CDI 中的碳?；哂蟹浅：玫募柞；磻?yīng)活性，可與羧酸反應(yīng)生成具有高反應(yīng)活性的?；溥颉ｕ；溥蚺c胺可在非常溫和的條件下生成相應(yīng)的酰胺［15］，可以應(yīng)用于多肽的合成。

所設(shè)計(jì)的綜合實(shí)驗(yàn)選擇操作簡單且易于掌握的方法來實(shí)施，便于學(xué)生實(shí)驗(yàn)的開展。將實(shí)驗(yàn)分解為載體制備與表征、納米粒子組裝與表征、基因的負(fù)載與表征和生物功能評價(jià)4 個(gè)模塊，較為全面體現(xiàn)了基因載體研究的基本內(nèi)容。通過該綜合實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生對基因載體的制備與評價(jià)有較為全面了解，并初步掌握基因載體的研究方法，是對高年級本科生進(jìn)行科研訓(xùn)練較為適宜的綜合實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過CDI 活化PEG 的羥基來制備PEG-PEI聚合物，聚合物和納米粒子表征結(jié)果表明，所制備聚合物可以高效負(fù)載pDNA，并將pDNA 導(dǎo)入細(xì)胞和表達(dá)綠色熒光蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要使用核磁、動態(tài)光散儀、凝膠電泳和倒置熒光顯微鏡和細(xì)胞培養(yǎng)箱等儀器。可使生物材料專業(yè)的學(xué)生掌握常見基因載體的制備方法，綜合運(yùn)用材料制備、納米粒子表征和生物評價(jià)等方面的知識解決問題，深化對生物材料設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用的認(rèn)識，鞏固理論課所學(xué)知識，培養(yǎng)高年級本科生操作能力和研究性科研思維能力，為其后續(xù)的學(xué)習(xí)深造和工作奠定良好的基礎(chǔ)。