淡豆豉關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的確定及標(biāo)準(zhǔn)修訂△

李寧新，盧志標(biāo)，馬瀟，李明華，郭曉晗，程顯隆*，魏鋒*，馬雙成

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.桂林三金藥業(yè)有限公司，廣西 桂林 541000；3.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000

淡豆豉為《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2015年版收載品種，其為豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品,具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效，臨床用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠[1]。研究表明，淡豆豉中的主要成分有大豆蛋白、異黃酮類(lèi)等[2-7]。

目前存在以黑蕓豆冒充淡豆豉、發(fā)酵不完全的質(zhì)量問(wèn)題，除《中國(guó)藥典》外，全國(guó)共有22個(gè)省市中藥飲片炮制規(guī)范收載了淡豆豉飲片，這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能控制上述質(zhì)量問(wèn)題?！吨袊?guó)藥典》(2015年版)存在的問(wèn)題一是來(lái)源中沒(méi)有明確是黑豆還是黃豆；二是性狀項(xiàng)下內(nèi)容不完善，沒(méi)有淡豆豉區(qū)別于黑蕓豆、料豆等其他豆類(lèi)的性狀特征描述；三是缺少專(zhuān)屬性的質(zhì)量控制指標(biāo)，薄層色譜鑒別專(zhuān)屬性不強(qiáng)，不能有效地區(qū)分黑蕓豆和淡豆豉；四是標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)法對(duì)淡豆豉是否發(fā)酵進(jìn)行界定。鑒于標(biāo)準(zhǔn)存在的上述問(wèn)題，對(duì)淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的來(lái)源、性狀、鑒別進(jìn)行了修訂，并增加了含量測(cè)定項(xiàng)，有效地控制淡豆豉質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀、Empower 色譜工作站；AE 204 型梅特勒-托利多萬(wàn)分之一電子天平；超純水儀(Millipore 公司)；KQ5200DE 型超聲波清洗儀(江蘇省金壇市宏凱儀器廠)。

1.2 試藥

染料木素、大豆異黃酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111704-201703、111502-200402，純度均為99.9%)；黃曲霉素混合對(duì)照品溶液(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：610001-201905)；冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：10000218)；乙腈(Fisher Chemical，色譜純，批號(hào)：178509)；水為自制超純水。

淡豆豉為按批準(zhǔn)文號(hào)生產(chǎn)的中藥飲片。本次實(shí)驗(yàn)研究收集了國(guó)內(nèi)20多家，25批次淡豆豉產(chǎn)品，包括各大型企業(yè)，樣品具有廣泛的代表性。同時(shí)收集了10批黑蕓豆發(fā)酵品，見(jiàn)表1。

表1 淡豆豉及黑蕓豆發(fā)酵品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 來(lái)源

本品為黑豆的發(fā)酵加工品。

2.2 性狀

本品呈橢圓形，略扁，長(zhǎng)0.6～1 cm，直徑0.5～0.7 cm，表面黑色，皺縮不平，一側(cè)有長(zhǎng)橢圓形種臍，質(zhì)地稍疏松，柔軟或脆。斷面棕黑色。氣香，味微甘。淡豆豉種臍典型特征見(jiàn)圖1A。偽品黑蕓豆發(fā)酵品的典型特征是種臍呈近圓形或橢圓形，約占總長(zhǎng)的1/6，見(jiàn)圖1B。

注：A.淡豆豉；B. 黑蕓豆發(fā)酵品。圖1 淡豆豉與黑蕓豆發(fā)酵品典型特征

2.3 薄層鑒別

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1 g，加乙醇25 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取淡豆豉對(duì)照藥材1 g，青蒿對(duì)照藥材0.2 g，同法分別制成對(duì)照藥材溶液。再取大豆苷元和染料木素對(duì)照品，分別加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶4∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與青蒿對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光主斑點(diǎn)；再置紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與淡豆豉對(duì)照藥材和大豆苷元、染料木素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。淡豆豉及其偽品黑蕓豆發(fā)酵品代表色譜圖見(jiàn)圖2。

注：A. 紫外光(365 nm)下檢視；B. 紫外光(254 nm)下檢視；1.大豆苷元；2.染料木素；3.青蒿對(duì)照藥材(批號(hào)：121016～201506)；4.淡豆豉對(duì)照藥材(批號(hào)：121594～201804)；5.淡豆豉樣品13；6.淡豆豉樣品14；7.黑蕓豆發(fā)酵品1；8.黑蕓豆發(fā)酵品2。圖2 淡豆豉及其偽品黑蕓豆發(fā)酵品薄層色譜圖

2.4 黃曲霉毒素

2.4.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇(35∶10)為流動(dòng)相A，以水流動(dòng)相B；采用光化學(xué)衍生器(254 nm)，以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，2個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)>1.5。

2.4.2對(duì)照品儲(chǔ)備液配制 取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的質(zhì)量濃度分別為1.02、0.43、1.06、0.38 μg·mL-1)1 mL稀釋至10 mL備用。色譜圖見(jiàn)圖3。

注：A.混合對(duì)照品；B.檢出限；C.樣品。圖3 黃曲霉素測(cè)定HPLC圖

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 取對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋5、10、20、50、100、200倍即得。以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2回歸方程分別為：Y=41.177X+10.182(r=0.996 5)；Y=93.94X+6.872 7(r=0.996 5)；Y=19.089 0X+3.914 8(r=0.996 4)；Y=48.545X+4.149 2(r=0.996 6)。

2.4.4供試品溶液的制備 取供試品粉末約15 g(過(guò)二號(hào)篩)，精密稱(chēng)定，置均質(zhì)瓶中，加氯化鈉3 g，精密加入70%的甲醇75 mL，高速攪拌2 min(攪拌速度>11 000 r·min-1)，2500 r·min-1(離心半徑為15 cm)離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL的量瓶中，1%的聚山梨酯20稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(玻璃纖維濾紙)濾過(guò)，取續(xù)濾液20 mL，過(guò)免疫親和柱，流速3 mL·min-1，用1%聚山梨酯20 10 mL洗脫，再用10 mL水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，將水吹干，用適量甲醇洗脫，收集洗脫液至2 mL量瓶中，并用甲醇定容，搖勻，即得。色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4.5樣品測(cè)定 按2.4.1、2.4.2、2.4.3項(xiàng)下對(duì)照品與供試品溶液制備方法，制得對(duì)照品和供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定即得。22批淡豆豉樣品結(jié)果顯示，有11批樣品檢出黃曲霉毒素B1，結(jié)果均小于1 μg·kg-1，黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2均未檢出。其余11批樣品中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2均未檢出。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱為固定相；以乙腈-1%冰醋酸(25∶75)為流動(dòng)相；流速為1 mL·min-1；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。理論板數(shù)按大豆苷元、染料木素峰計(jì)算均不得低于5000。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 取大豆苷元對(duì)照品、染料木素對(duì)照品各10 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含大豆苷元21.14 μg，染料木素各18.01 μg)。見(jiàn)圖4。

2.5.3供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得(見(jiàn)圖4)。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；1.大豆苷元；2.染料木素。圖4 淡豆豉含量測(cè)定對(duì)照品及樣品HPLC圖

2.5.4線性關(guān)系考察 取大豆苷元和染料木素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制成每1 mL含大豆苷元21.14 μg、染料木素18.01 μg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液各1、2、5、10、15、20、25、30 μL，按擬定色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。大豆苷元的回歸方程為Y=5 000 000X-1 182.3，線性范圍為0.021 14～0.634 2 μg，r=1；染料木素的回歸方程為Y=8 000 000X-4 376.3，線性范圍為0.018 0～0.540 3 μg，r=0.999 9。

2.5.5精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按照2.5.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果6次進(jìn)樣所測(cè)得色譜峰的峰面積RSD均小于1.0%，表明精密度良好。

2.5.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、4、8、12、24、48 h按照2.5.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果6次進(jìn)樣所測(cè)得色譜峰的峰面積RSD均小于1.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.5.7重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取同一批樣品(樣品16)6份，按2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果大豆苷元平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.070 6%，RSD為0.61%，染料木素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.031 1%，RSD為0.72%，表明重復(fù)性良好。

2.5.8加樣回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)已測(cè)知含量(大豆苷元0.705 7 mg·g-1、染料木素0.310 7 mg·g-1)的藥材(樣品16)粉末0.50 g，精密稱(chēng)定，精密加入大豆苷元、染料木素混合對(duì)照品溶液(大豆苷元15.8 μg·mL-1、染料木素6.4 μg·m L-1)25 mL，按照擬定的方法制備供試品溶液，平行制備6份，按擬定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果大豆苷元加樣回收率為102.15%，RSD為0.92%；染料木素加樣回收率為100.22%，RSD為1.27%，結(jié)果見(jiàn)表2。表明方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 淡豆豉大豆苷元、染料木素加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.5.9樣品測(cè)定 按2.5.2和2.5.3項(xiàng)下供試品與對(duì)照品溶液制備方法，制得供試品和對(duì)照品溶液。精密吸取大豆苷元、染料木素混合對(duì)照品溶液(大豆苷元21.14 μg·mL-1、染料木素18.01 μg·mL-1)10 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果(按干燥品計(jì)算)見(jiàn)表3。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，20批淡豆豉大豆苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020 7%～0.107 8%，染料木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.007 2%～0.077 3%，大豆苷元和染料木素含量總和為0.038 4%～0.175 0%，含量總和平均值為0.088%。由于含量范圍變化幅度較大，根據(jù)樣品發(fā)酵實(shí)際情況，將限度設(shè)定為0.040%。

3 討論

淡豆豉的基原規(guī)定了本品為豆科植物大豆G.max(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品。大豆有黃豆、黑豆兩大類(lèi)。經(jīng)本草考證，唐代《日華子本草》、明代《雷公藥性賦》《本草逢原》《神農(nóng)本草經(jīng)疏》中認(rèn)為“豆惟黑者入藥”；宋代蘇頌的《本草圖經(jīng)》中記載“大豆有黑白二種，黑者入藥，白者不用”。明代李時(shí)珍也認(rèn)為應(yīng)以黑豆入藥。并且在一些地方炮制規(guī)范中，均明確以黑豆為原料生產(chǎn)淡豆豉。《中國(guó)藥典》(2015年版)淡豆豉標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有明確規(guī)定到底用哪種大豆，但性狀描述為表面黑色，為黑豆發(fā)酵品的顏色。因此，建議標(biāo)準(zhǔn)中基原應(yīng)明確為黑豆。鑒于黑豆藥材已被收載于《中國(guó)藥典》(2015年版)，建議來(lái)源描述為：本品為黑豆的發(fā)酵加工品。

目前，淡豆豉的主要質(zhì)量問(wèn)題是以黑蕓豆冒充黑豆投料。經(jīng)過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)淡豆豉和黑蕓豆可以從種臍的性狀進(jìn)行區(qū)分，但這個(gè)特征沒(méi)有在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)出來(lái)?，F(xiàn)將淡豆豉與發(fā)酵黑蕓豆的來(lái)源、性狀區(qū)別比較：黑豆為豆科大豆屬，屬于大豆類(lèi)，富含蛋白質(zhì)，種臍長(zhǎng)橢圓形，約占總長(zhǎng)的1/3，胚芽未發(fā)育成真葉；黑蕓豆為豆科菜豆屬，屬于淀粉豆類(lèi)，富含淀粉，豆仁白色，種臍近圓形或橢圓形，約占總長(zhǎng)的1/6，胚芽已發(fā)育為真葉的雛形。鑒于種臍特征最明顯，在實(shí)際檢驗(yàn)檢測(cè)中容易判斷。因此，建議把種臍特征寫(xiě)入標(biāo)準(zhǔn)中。

按《中國(guó)藥典》(2015年版)一部淡豆豉項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行試驗(yàn)，在硅膠G板上展開(kāi)，紫外光(365 nm)下檢視，淡豆豉和黑蕓豆發(fā)酵品均與淡豆豉和青蒿對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。說(shuō)明該薄層方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)，無(wú)法區(qū)分正偽品。并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中的染料木素和大豆苷元在紫外光(365 nm)下不顯示斑點(diǎn)，說(shuō)明在紫外光(365 nm)下檢視的不是大豆異黃酮類(lèi)成分。將染料木素和大豆苷元在GF254硅膠板上展開(kāi)，置于紫外光(254 nm)下，則顯示出熒光淬滅斑點(diǎn)。因此，通過(guò)改變薄層板和優(yōu)化開(kāi)劑比例，增加染料木素和大豆苷元為對(duì)照品，提高薄層鑒別方法的專(zhuān)屬性。將展開(kāi)劑由甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)改為甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶4∶0.5)，薄層板由硅膠G板改為硅膠GF254，在紫外光(254 nm)下檢視，淡豆豉在與染料木素和大豆苷元對(duì)照品、淡豆豉對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光淬滅斑點(diǎn)，偽品黑蕓豆發(fā)酵品在與染料木素和大豆苷元對(duì)照品、淡豆豉對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的熒光淬滅斑點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，25批正品淡豆豉薄層斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，而10批偽品均未出現(xiàn)相應(yīng)的薄層斑點(diǎn)，說(shuō)明更改后的淡豆豉薄層方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于鑒別正偽品。

鑒于淡豆豉在發(fā)酵的過(guò)程中，需要微生物參與。為了考察淡豆豉是否引入黃曲霉，進(jìn)行了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2測(cè)定。在測(cè)定的22批淡豆豉樣品中，只有11批樣品檢出黃曲霉毒素B1，并且結(jié)果均小于1 μg·kg-1，低于《中國(guó)藥典》(2015年版)中5 μg·kg-1的限度。鑒于上述情況，建議暫不將黃曲霉毒素的檢測(cè)納入《中國(guó)藥典》。

已有文獻(xiàn)報(bào)道淡豆豉中異黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定方法[8-10]，其中包括對(duì)淡豆豉中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木素6種異黃酮類(lèi)成分的測(cè)定。鑒于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，應(yīng)以最低的檢測(cè)成本，達(dá)到最有效質(zhì)量控制的目的為原則。實(shí)驗(yàn)考察發(fā)酵前后黑豆中6種異黃酮類(lèi)的含量變化，結(jié)果顯示，發(fā)酵前的黑豆中結(jié)合型異黃酮大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷的含量較高，游離型大豆苷元、染料木素、黃豆黃素的含量很低；發(fā)酵后，淡豆豉中結(jié)合型異黃酮大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷的含量明顯降低，游離型異黃酮大豆苷元、染料木素、黃豆黃素的含量明顯增高。結(jié)合型異黃酮與游離型異黃酮成負(fù)相關(guān)。并且，3種游離型異黃酮成正相關(guān)，因此只對(duì)含量較高的2個(gè)異黃酮類(lèi)成分大豆苷元、染料木素進(jìn)行測(cè)定，就可以反映淡豆豉中的異黃酮類(lèi)成分。實(shí)驗(yàn)還對(duì)黑蕓豆發(fā)酵樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10批黑蕓豆發(fā)酵品僅4批次檢出極微量的大豆苷元峰，其余黑蕓豆發(fā)酵品中幾乎不含大豆苷元、染料木素。因此，選定的含量測(cè)定指標(biāo)大豆苷元、染料木素能夠有效地鑒別偽品，有效地控制淡豆豉的質(zhì)量。