防己藥材 飲片及標準湯劑UPLC特征圖譜研究

張文芳，林碧珊，梁浩明，徐彤彤，胡梅，吳志權

國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303

國家藥典委員會在2016年發(fā)布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》提出，中藥配方顆粒以標準湯劑作為與臨床湯劑療效基本一致的標準參照物。深入開展標準湯劑特征圖譜研究成為搭建藥材-飲片-提取物-配方顆粒全產業(yè)鏈質量控制體系的關鍵環(huán)節(jié)，有助于中藥配方顆粒接軌歐盟注冊要求，實現(xiàn)中藥國際化。

防己為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore 的干燥根，具有祛風止痛、利水消腫之功，主要用于風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒[1]。本研究建立防己藥材-飲片-標準湯劑的UPLC特征圖譜，為防己配方顆粒質量控制標準及歐盟注冊申報提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC 液相系統(tǒng)包括二元高壓泵、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器(Waters公司)；CORTECS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；MS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水儀(Millipore公司)。

防己諾林堿對照品(批號：110793-201606，純度：98.8%)、粉防己堿對照品(批號：110711-201609，純度：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿對照品(成都普菲德生物技術有限公司，批號：150813，純度≥98%)；防己對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121279-201502)；無水乙醇為分析純；乙腈和磷酸均為色譜純；超純水由MILLIPORE純水儀制備。

15批防己藥材分別于2016年8月—2018年3月收集于江西和安徽不同種植產地，詳見表1，經(jīng)本單位質管部黃國滿主管中藥師鑒定為防己科植物粉防己S.tetrandraS. Moore 的干燥根。由本實驗室按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部炮制項要求制成同批號防己飲片，依據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準指定技術要求(征求意見稿)》制備同批號防己標準湯劑凍干粉。

表1 15批不同產地防己樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參考相關文獻方法[2-4]并對洗脫梯度、流動相組成、檢測波長、色譜柱、柱溫、流速等系統(tǒng)適應性條件進行優(yōu)化，得到色譜條件如下，色譜柱：CORTECS T3 C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，洗脫梯度(0～3 min，0%A；3～5 min，0%～15%A；5～25 min，15%～30%A；25～29 min，30%～80%A)；流速：0.2 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：0.2 μL。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取防己諾林堿和粉防己堿對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為19.9、300.6 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得；取木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為141 μg·mL-1的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1防己藥材和飲片供試品溶液的制備 前期考察藥材特征圖譜供試品制備方法，發(fā)現(xiàn)《中華人民共和國藥典》含量測定項所用2%鹽酸甲醇對防己諾林堿和粉防己堿的提取效果與30%乙醇一致，但對其他成分的提取效果不及30%乙醇，故選用30%乙醇作為提取媒介更能全面反映特征圖譜屬性。得到供試品溶液制備方法：精密稱取本品粉末(過三號篩)約0.2 g，置具塞錐形瓶，精密量取30%乙醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放涼，用30%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2防己標準湯劑供試品溶液制備 取本品適量，研細，取約0.07 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，加30%乙醇適量使溶解，超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)10 min，取出，放涼，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1系統(tǒng)適應性 取木蘭花堿、粉防己堿和防己諾林堿參照物溶液進行色譜峰標定，比較保留時間和紫外吸收光譜圖，確定樣品色譜圖中的峰歸屬。粉防己堿色譜峰為所有批次藥材、飲片和標準湯劑所共有，其分離度良好，且為防己的藥效成分和專屬性成分，故以此為參照峰(S峰)，規(guī)定理論塔板數(shù)按粉防己堿峰計算應不低于8000。

2.4.2精密度試驗 取同批次防己供試品，按2.3項制備供試品溶液各1份，在2.1項色譜條件下，連續(xù)進樣測定6次，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3重復性試驗 取同批次防己供試品共6份，按2.3項制備2組供試品溶液各6份，在2.1項色譜條件下進樣分析，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗 取同批次防己供試品，按2.3項制備供試品溶液各1份，在2.1項色譜條件下于0、2、4、8、12、16、20、24 h分別進樣，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測定

按2.1項下色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液各0.2 μL進樣測定，記錄色譜圖，見圖1～4。

注：A.木蘭花堿對照品溶液；B.混合對照品溶液；1. 木蘭花堿；2.防己諾林堿；3. 粉防己堿。圖1 木蘭花堿對照品溶液與防己諾林堿、粉防己堿混合對照品溶液的UPLC圖

圖2 15批防己藥材UPLC特征圖譜及其對照特征圖譜

圖3 15批防己飲片UPLC特征圖譜及其對照特征圖譜

圖4 15批防己標準湯劑UPLC特征圖譜及其對照特征圖譜

2.6 共有峰的標定

將各批防己藥材、飲片及標準湯劑所得結果分別導入國家藥典委員會發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)，選擇時間窗寬度為0.10 min，平均數(shù)法生成對照圖譜，對色譜圖進行多點校正后，自動匹配，生成圖譜，經(jīng)分析比對后確定11個共有峰，見圖2～4。與木蘭花堿、防己諾林堿和粉防己堿對照色譜圖進行比對，確定7號峰為木蘭花堿，10號峰為防己諾林堿，11號峰為粉防己堿。防己藥材、飲片和標準湯劑對照特征圖譜見圖5。以峰11(粉防己堿)為參照峰，分別計算防己藥材、飲片和標準湯劑各共有峰的相對保留時間和相對峰面積(RA)，結果見表2。

圖5 防己藥材、飲片和標準湯劑UPLC對照特征圖譜的比較

2.7 相關性分析

采用相似度評價系統(tǒng)對所有色譜圖數(shù)據(jù)進行分析，以均值法生成特征圖譜的共有模式，計算各批藥材、飲片和標準湯劑樣品的相似度，結果見表3。15批防己藥材特征圖譜與對照特征圖譜的相似度為0.978～0.999；飲片為0.976～0.998；標準湯劑為0.962～0.999。表明藥材、飲片與標準湯劑整體成分具有相似性，防己從藥材-飲片-標準湯劑過程中各成分得到有效轉移。

3 討論

防己諾林堿和粉防己堿是防己藥材中主要的藥效成分和專屬性成分[5-6]。近年來有研究報道，通過比較防己水提物及其活性單體的毒效關系，發(fā)現(xiàn)防己水提物的鎮(zhèn)痛效果更優(yōu)，粉防己堿作為防己的主要組分并不能夠完全表征防己的藥效；防己水提物停藥后的肝臟毒性可逆性是粉防己堿停藥后所不具備的，提示其水溶性強、極性大的生物堿類成分起了協(xié)同和持續(xù)的作用[7-8]。本研究通過防己藥材-飲片-標準湯劑特征圖譜分析，確定11個共有特征峰，15批防己藥材、飲片和標準湯劑的相似度分別大于0.90，相似度較高，表明防己從藥材經(jīng)過飲片制備，到標準湯劑其成分一致，三者特征圖譜具有良好的相關性；此外，研究組通過定量分析發(fā)現(xiàn)，15批防

表2 防己藥材、飲片及標準湯劑UPLC特征圖譜分析

表3 防己藥材、飲片和標準湯劑的相似度計算結果

己標準湯劑出膏率為10.4%～18.3%，2個藥效指標成分粉防己堿和防己諾林堿的總量從飲片到標準湯劑的轉移率為18.9%～39.3%?；诙恐笜?，結合特征圖譜可為防己配方顆粒的質量控制提供更為科學的依據(jù)。以粉防己堿色譜峰為參照峰，分別計算防己藥材、飲片和標準湯劑各共有峰的相對峰面積，發(fā)現(xiàn)藥材和飲片各共有峰的RA值基本相符，但標準湯劑RA值有提高趨勢，主要原因可能是極性較大成分提取率較高，導致相對峰面積差異變大。