地黃葉片響應(yīng)遮陰處理的分子響應(yīng)機(jī)制解析△

李明杰，謝彩俠，古力，楊超飛，杜家方，王豐青*，張重義*

1.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002

藥用植物與棲息地生境的相互作用是藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成的重要原因。其中，光照是影響藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成的核心生態(tài)因子，也是植物初生和次生代謝途徑的重要驅(qū)動(dòng)因子。藥用植物所處生態(tài)區(qū)域的海拔、坡向、經(jīng)緯度不同，其所受到光照輻射參數(shù)也存在明顯的差異。藥用植物在長(zhǎng)期適應(yīng)特定地區(qū)的光照尺度變化過(guò)程中，逐漸的適應(yīng)并固化這些光照特質(zhì)，形成了不同光照需求度和喜光特性以及特定外形[1]。因此，光照條件對(duì)于特定生態(tài)區(qū)中外源遷徙和馴化植物的成功生存起著極其重要的作用，是決定植物能否成功馴化并進(jìn)化的重要決定性因素之一[2]。因此，光照也成為藥用植物道地性形成過(guò)程中最為重要的生境支配因素之一。目前，光照強(qiáng)度對(duì)陰生藥用植物影響的研究相對(duì)較多，但大部分研究集中在最適光強(qiáng)、光質(zhì)的篩選以及光照對(duì)藥用植物活性成分誘導(dǎo)性效應(yīng)；但光照是如何調(diào)控藥用植物發(fā)育和影響藥用植物次生代謝合成的，其具體機(jī)制尚不清晰。

地黃RehmanniaglutinosaL.是玄參科植物，以塊根入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，為常用大宗藥材。地黃藥材味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，功用清熱生津、涼血、止血。道地產(chǎn)區(qū)為古“懷慶府”，即今河南焦作地區(qū)，包括溫縣、武陟、博愛(ài)、沁陽(yáng)等沁河兩岸部分縣區(qū)[3-4]。目前，在道地產(chǎn)區(qū)常年都有很大的種植面積，產(chǎn)值達(dá)數(shù)十億元。在非道地產(chǎn)區(qū)山西、山東、河北也有較大的種植面積，甘肅、黑龍江等省份也有種植。地黃是典型的喜光藥用植物之一，合適的光照強(qiáng)度對(duì)于地黃植株的形態(tài)建成、塊根發(fā)育和藥用成分合成起著極其重要的作用。在地黃的栽培生產(chǎn)實(shí)踐中，充足的光照是保證地黃產(chǎn)量和品質(zhì)的重要前提條件之一。前期研究發(fā)現(xiàn)地黃葉片和根組織中均含有毛蕊花糖苷、梓醇等地黃的代表性藥用活性成分，而遮陰則能顯著影響地黃的葉片發(fā)育，同時(shí)，導(dǎo)致其中毛蕊花糖苷的含量降低，遮陰程度越高其降低幅度越大[3]。為了進(jìn)一步詳細(xì)探究光照強(qiáng)度與地黃葉片發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的累積機(jī)制間的關(guān)聯(lián)性，本研究以地黃作為研究材料，通過(guò)遮陰的方法人為模擬出不同光照強(qiáng)度條件，探究不同光照強(qiáng)度對(duì)地黃生長(zhǎng)發(fā)育的影響；同時(shí)，用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)解析不同光照強(qiáng)度對(duì)地黃轉(zhuǎn)錄水平的擾動(dòng)效應(yīng)，從分子水平上探究光照強(qiáng)度對(duì)地黃葉片發(fā)育及內(nèi)在代謝機(jī)制的影響。以期為闡明光照因子對(duì)藥用植物代謝積累機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也為道地藥材的形成機(jī)制和建立合理的耕作制度研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與遮陰處理

選用地黃品種“溫85-5”作為遮陰處理對(duì)象，經(jīng)河南中醫(yī)藥研究院張留記研究員鑒定，所用實(shí)驗(yàn)材料為R.glutinosaL.。受試地黃“種栽”播種于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)隔離實(shí)驗(yàn)田內(nèi)，生長(zhǎng)發(fā)育期間的栽培管理措施與大田生產(chǎn)保持嚴(yán)格一致。在地黃出苗30 d后，利用不同透光水平的遮陰網(wǎng)進(jìn)行梯度遮陰處理。具體操作方法如下：設(shè)置3個(gè)處理組，每組處理選擇80～100株地黃苗。在地黃出苗后30 d左右，保留1組地黃在正常光照下進(jìn)行生長(zhǎng)(全光照)，剩余2組地黃則分別進(jìn)行60%和90%的遮光處理，3組處理平行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有處理分別在遮陰處理后的30、60、150 d取樣，每處理隨機(jī)取10株長(zhǎng)勢(shì)一致植株，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)其葉長(zhǎng)、葉寬及葉片數(shù)等葉部關(guān)鍵參數(shù)。選取不同處理下30 d的葉組織制備石蠟切片，詳細(xì)觀察其組織結(jié)構(gòu)的差異，同時(shí)，將90%遮陰及全光照樣品用液氮凍存，進(jìn)行下游的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲取遮陰處理下葉內(nèi)的關(guān)鍵分子響應(yīng)進(jìn)程。

1.2 RNA-Seq及分析

用TRIzol法提取不同遮陰處理地黃葉的總RNA，利用DNase I去除樣品總RNA中殘存DNA片段。然后，利用嵌有Oligo(dT)接頭的磁珠對(duì)樣品中的mRNA進(jìn)行富集。對(duì)富集出的mRNA進(jìn)行片段化處理，并以這些碎片化的mRNA為擴(kuò)增模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA樣品在經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、測(cè)序接頭添加、特定片段切膠回收、多輪擴(kuò)增及純化等一系列步驟后，完成測(cè)序文庫(kù)的制備。利用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System對(duì)所已經(jīng)構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)量和產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)測(cè)，將經(jīng)過(guò)質(zhì)控檢測(cè)的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序(華大基因)，選用Ion Proton平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)測(cè)序所獲取的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控處理，過(guò)濾掉其中低質(zhì)量、接頭等污染序列，獲取clean reads序列。將clean reads與地黃參考序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)不同樣品的reads比對(duì)率以及分布，進(jìn)一步評(píng)估不同樣品所獲取的reads序列中外源序列污染水平。在此基礎(chǔ)上，根際地黃參考序列中reads匹配數(shù)來(lái)計(jì)算不同樣品轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，表達(dá)量用FPKM表示。對(duì)比分析遮陰前后地黃葉片中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，獲取響應(yīng)遮陰處理的特異響應(yīng)基因，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，獲取遮陰處理下地黃葉片內(nèi)關(guān)鍵分子響應(yīng)進(jìn)程。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取不同處理葉片的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。反轉(zhuǎn)錄體系：<2 μg總RNA，1 μL oligo dT Primer(50 μmol·L-1)，0.5 μL RNAase Inhibitor(40 U·μL-1)，1 μL dNTP Mixture，4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer，1 μL的PrimeScript Ⅱ RTase(200 U·μL-1)，加ddH2O補(bǔ)充至20 μL。在42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以不同差異基因的編碼區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)qPCR引物(見(jiàn)表1)，選用RgTIP41基因作為內(nèi)參。利用SYBRPremix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (Takara，大連)熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒對(duì)不同基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。qPCR采用25 μL反應(yīng)體系，包括2 μL上述反轉(zhuǎn)錄cDNA，1 μL上游引物(10 μmol·L-1)，1 μL下游引物(10 μmol·L-1)，12.5 μL SYBRPremix ExTaq，8.5 μL ddH2O。具體反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃下30 s；95 ℃下5 s，60 ℃下30 s，循環(huán)數(shù)40。反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出不同樣品的擴(kuò)增Ct循環(huán)數(shù)，利用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算不同轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮陰對(duì)地黃葉片的表型和組織解構(gòu)的影響

為了詳細(xì)了解不同光照強(qiáng)度對(duì)地黃葉片生長(zhǎng)和發(fā)育影響，在大田條件下，在其他因素不變情況下，分別用60%、90%的遮陰網(wǎng)對(duì)地黃進(jìn)行人為的遮陰處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遮陰后地黃的生長(zhǎng)受到明顯的影響。遮陰后地黃葉片變平展，葉色由黃綠變深綠(見(jiàn)圖1A)。葉片上的泡狀凸起減少或變小，且隨著遮陰程度的增加而消失(見(jiàn)圖1A)。葉片變薄，葉肉柵欄組織和海綿組織細(xì)胞減少、變小(見(jiàn)圖1B)。遮陰30 d后，2種遮陰葉片大小與對(duì)照相差不多，但葉片數(shù)量減少；遮陰60 d時(shí)，90%遮陰的葉片長(zhǎng)度、寬度和葉片數(shù)均顯著低于60%遮陰和未遮陰對(duì)照；150 d時(shí)，60%和90%遮陰的葉片長(zhǎng)度、寬度和葉片數(shù)均顯著低于未遮陰對(duì)照(見(jiàn)圖1C)。說(shuō)明遮陰對(duì)地黃地黃部葉片的生長(zhǎng)有著顯著的影響，且隨著遮陰程度的增加和遮陰時(shí)間的延長(zhǎng)表型變化更加明顯。

表1 用于確認(rèn)RNA-Seq差異表達(dá)基因準(zhǔn)確性的qPCR引物

注：A.遮陰對(duì)地黃葉片泡狀凸起的影響；B.遮陰對(duì)地黃葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響；C.遮陰對(duì)地黃葉片長(zhǎng)度、寬度和葉片數(shù)的影響。圖1 遮陰對(duì)地黃葉片生長(zhǎng)的影響

2.2 遮陰對(duì)地黃葉內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程的影響

為了深入解析遮陰處理對(duì)地黃葉片內(nèi)在分子進(jìn)程的影響，選取對(duì)地黃葉片表型和組織解構(gòu)具有明顯影響的90%遮陰處理，通過(guò)RNA-Seq技術(shù)詳細(xì)分析其與正常葉片間的響應(yīng)基因差異。結(jié)果在全光照地黃、90%遮陰的地黃的葉中分別獲取了11 865 182和10 606 388個(gè)clean reads(見(jiàn)表2)。將這些序列與前期已經(jīng)構(gòu)建的地黃轉(zhuǎn)錄組庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)全光照和遮陰處理葉中分別有98.99%和98.91%的clean reads可以匹配到轉(zhuǎn)錄組上，其中，特異匹配的序列分別占到總序列的76.00%和75.32%。從2個(gè)樣品的reads匹配率可以明顯看出，2個(gè)樣品中所產(chǎn)生的clean reads，有98%以上的序列可以匹配到地黃轉(zhuǎn)錄組，說(shuō)明2個(gè)樣品的測(cè)序質(zhì)量均達(dá)到了較高水平，可以進(jìn)行下游的定量分析。

為了進(jìn)一步獲取遮陰處理和正常光照間的差異響應(yīng)基因，分別將遮陰處理樣品和對(duì)照樣品的基因進(jìn)行定量，同時(shí)，進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2393個(gè)基因在90%遮陰處理和對(duì)照間出現(xiàn)差異表達(dá)，其中，有1456個(gè)基因在遮陰處理后葉內(nèi)顯著上調(diào)，有937個(gè)下調(diào)(見(jiàn)圖2)。為了確證這些通

表2 遮陰處理地黃和對(duì)照地黃葉片RNA-seq測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

注：A.遮陰處理地黃與正常光照處理地黃間顯著差異表達(dá)基因分析；B.遮陰處理地黃與正常光照處理間顯著差異表達(dá)基因數(shù)量。圖2 遮陰處理與正常光照(全光照)地黃葉片間顯著差異表達(dá)基因的鑒定與篩選

過(guò)數(shù)字基因表達(dá)分析所獲取差異基因的準(zhǔn)確性，從上述顯著差異表達(dá)的基因中挑選RgWRKY(CL4160.Contig2)、RgBRI-KI(CL4599.Contig2)、RgA-AAR(CL3002.Contig2)、RgERF(Unigene2558)、RgMYB(Unigene21429)、RgEXPA8(Unigene10535)、RgEXPA1(Unigene13756)和RgCAD(CL379.Contig1)等8個(gè)基因，利用 qRT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)qRT-PCR 與通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜分析中所獲取的上、下調(diào)基因的差異表達(dá)趨勢(shì)基本一致，相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.936(見(jiàn)圖3)，這表明本研究通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜方法所鑒定差異基因是較為可靠性的。

圖3 RNA-seq數(shù)據(jù)與qRT-PCR結(jié)果的相關(guān)性分析

2.3 地黃葉片中響應(yīng)遮陰處理關(guān)鍵基因的功能分析

為了解析遮陰處理下地黃葉片中關(guān)鍵表達(dá)基因功能，將已經(jīng)獲取差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG功能注釋。GO功能分類主要從分子功能(molecularfunction)、細(xì)胞位置(cellular component)、生物進(jìn)程(biological process)3個(gè)層級(jí)上來(lái)描述相應(yīng)基因的功能。詳細(xì)分析遮陰處理和對(duì)照間差異基因的GO的功能分類發(fā)現(xiàn)：在生物進(jìn)程分類中有22個(gè)GO條目匹配了相應(yīng)差異基因，其中，細(xì)胞代謝進(jìn)程(metabolic process)和細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)條目中所包含的基因數(shù)量最多，而細(xì)胞節(jié)律(rhythmic process)和細(xì)胞殺傷性(cell killing)條目中基因最少。在細(xì)胞位置分類中，共有11類GO條目匹配了相應(yīng)基因，其中，細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部位(cell part)2個(gè)條目中所匹配的基因數(shù)量相對(duì)較多，細(xì)胞器(organelle)條目中較少，細(xì)胞連接(cell junction)、胞外區(qū)部位條目中所占基因數(shù)量最少。此外，在分子功能分類中，共有10類GO條目匹配了相應(yīng)基因，其中，催化劑活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)條目所匹配的基因最多，其次為轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)，其它7類GO條目所匹配基因總數(shù)均在50以下(見(jiàn)圖4)。上述結(jié)果表明遮陰處理影響了地黃葉內(nèi)的多重細(xì)胞進(jìn)程。

同時(shí)，為進(jìn)一步深入解析遮陰處理內(nèi)葉片差異響應(yīng)基因功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲取的差異基因所涉及的代謝通路進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)遮陰處理與對(duì)照間有 1278個(gè)差異表達(dá)基因可以富集歸類到120個(gè)代謝進(jìn)程中，占總差異基因的53.4%，有23個(gè)

圖4 遮陰后地黃葉片中差異表達(dá)的基因GO分類

代謝通路達(dá)到了顯著富集水平(P<0.05)(見(jiàn)表3)。其中，有139個(gè)差異基因在真菌和植物互作進(jìn)程中(Plant-pathogen interaction)顯著富集，占到總差異基因的10.88%，這側(cè)面反應(yīng)了遮陰可能引發(fā)了植物葉片內(nèi)應(yīng)激逆境響應(yīng)。有104個(gè)差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)通路中顯著富集，這說(shuō)明遮陰處理擾動(dòng)了地黃葉片中正常激素信號(hào)系統(tǒng)響應(yīng)，間接影響了葉片的正常生長(zhǎng)發(fā)育。有59個(gè)差異表達(dá)基因在苯乙醇苷類物質(zhì)生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)通路也被顯著富集，這表明遮陰處理可能影響了地黃葉片中次生代謝產(chǎn)物的正常合成。此外，值得注意的是，與淀粉與蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、類胡蘿卜素生物合成(Carotenoid biosynthesis)、黃酮類物質(zhì)的生物合成(Flavonoid biosynthesis)、單萜類物質(zhì)的生物合成(Monoterpenoid biosynthesis)以及倍半萜和三萜類物質(zhì)的生物合成(Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)等初生、次生代謝進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)的通路中也顯著富集了大量差異表達(dá)基因，這表明遮陰處理顯著影響了地黃初生代謝以及次生代謝產(chǎn)物正常合成進(jìn)程，從而間接的影響了地黃葉內(nèi)干物質(zhì)的積累以及關(guān)鍵藥用活性成分的累積。總之，通過(guò)遮陰處理下關(guān)鍵差異基因的功能途徑的初步解析，為進(jìn)一步了解地黃葉片生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝產(chǎn)物積累的分子調(diào)控機(jī)制研究提供了關(guān)鍵參考信息。

表3 遮陰處理后差異基因富集的前25個(gè)代謝通路

2.4 地黃葉片中響應(yīng)遮陰處理關(guān)鍵分子事件

2.4.1遮陰處理干擾了光合通路關(guān)鍵基因的表達(dá) 分析遮陰后地黃葉片中參與光合作用相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)參與光合通路(Photosynthesis)的11個(gè)基因均在遮陰后下調(diào)表達(dá)(見(jiàn)表4)。這些基因主要包括光系統(tǒng)I的P700 葉綠體a脫輔基蛋白A2基因psaA和亞基Ⅷ基因psaI，光系統(tǒng)II的反應(yīng)中心D1蛋白基因PsbA和13 kDa蛋白基因Psb28，細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體的脫細(xì)胞色素f基因petA，以及F-ATP酶α基因、β基因和a亞基基因。

2.4.2遮陰處理影響了葉片中關(guān)鍵激素代謝和關(guān)鍵信號(hào)通路 在遮陰地黃葉片差異基因富集的KEGG信號(hào)通路中，植物激素信號(hào)通路顯著被富集(見(jiàn)表5)。鑒定出生長(zhǎng)素信號(hào)通路中AUX1基因、AUX/IAA蛋白基因、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白ARF基因和生長(zhǎng)素應(yīng)答GH3基因等17個(gè)多數(shù)差異表達(dá)的基因，在遮陰后的地黃葉片中14個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，僅有3個(gè)下調(diào)表達(dá)。在細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中，細(xì)胞分裂素受體蛋白基因CRE1、 B型ARR蛋白基因上調(diào)表達(dá)，A型ARR蛋白基因下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明遮陰后葉片細(xì)胞的分化受了影響。在赤霉素信號(hào)通路中，有10個(gè)DELLA蛋白基因均呈下調(diào)表達(dá)。乙烯信號(hào)通路中，1個(gè)乙烯受體蛋白基因ETR下調(diào)表達(dá)，而5個(gè)蘇氨酸蛋白激酶基因CTR1均呈上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明遮陰處理改變了葉片內(nèi)關(guān)鍵激素信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能，這種變化更多的體現(xiàn)了葉片在弱光環(huán)境下適應(yīng)性調(diào)節(jié)變化。

表4 RNA-Seq分析鑒定的光合系統(tǒng)相關(guān)的差異表達(dá)基因

表5 RNA-Seq分析鑒定的激素調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因

續(xù)表5

2.4.3遮陰處理抑制了梓醇和毛蕊花糖苷合成通路中關(guān)鍵催化酶基因的表達(dá) 梓醇和毛蕊花糖苷是地黃植株中標(biāo)志性藥用活性成分，為了解析遮陰對(duì)地黃葉片中2種關(guān)鍵藥用活性成分的影響，對(duì)遮陰處理下梓醇和毛蕊花糖苷代謝通路中關(guān)鍵催化酶基因的表達(dá)變化進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鑒定出12個(gè)差異表達(dá)的催化酶基因涉及梓醇合成，其中11個(gè)下調(diào)表達(dá)，僅有1個(gè)基因上調(diào)表達(dá)(見(jiàn)表6)。在下調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵基因中，包括1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶(HDR)和異戊二烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶(IPI)等萜類成分合成的骨干催化酶。此外，梓醇合成通路中的關(guān)鍵酶異戊二烯合酶(GES)、8-羥基香葉醇脫氫酶(10HGO)和鯊烯單加氧酶(SQM)在遮陰也呈現(xiàn)顯著下調(diào)。這些與梓醇、毛蕊花糖苷合成密切相關(guān)催化酶基因的下調(diào)表達(dá)，暗示著遮陰對(duì)萜類成分的積累可能具有明顯的抑制作用。

對(duì)毛蕊花糖苷合成通路中的關(guān)鍵催化酶基因在遮陰后的表達(dá)變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有10個(gè)基因出現(xiàn)顯著差異表達(dá)(見(jiàn)表7)。其中，2個(gè)苯丙氨酸解氨酶基因PAL在遮陰后顯著上調(diào)表達(dá)，5個(gè)4-香豆素-CoA連接酶基因4CL中有4個(gè)則在遮陰后下調(diào)表達(dá)。在酪氨酸途徑中，有3個(gè)多酚氧化酶PPO基因，2個(gè)在遮陰后上調(diào)表達(dá)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些下調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵催化酶基因可能在地黃毛蕊花糖苷的合成和積累中起著重要作用。

表6 通過(guò)RNA-seq分析鑒定到的參與梓醇合成的差異表達(dá)基因

表7 通過(guò)RNA-seq分析鑒定到的參與毛蕊花糖苷合成的差異表達(dá)基因

3 討論

光照強(qiáng)度主要通過(guò)光周期、光強(qiáng)(光密度)和光質(zhì)影響藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程和活性成分合成。如：許翔鴻等[5]在延胡索栽培中發(fā)現(xiàn)適當(dāng)遮蔭可顯著提高其生物堿含量；向紅等[6]發(fā)現(xiàn)不同光照強(qiáng)度顯著影響當(dāng)歸產(chǎn)量及阿魏酸含量。因此，在藥用植物栽培生產(chǎn)中，需根據(jù)藥用植物典型的需光特性，人為配置合適光照強(qiáng)度(光配方)以提高其產(chǎn)量和藥用品質(zhì)。如：典型的喜陰藥用植物三七，適當(dāng)遮蔭是其生產(chǎn)中必須考慮栽培措施[7]；金線蓮是典型的林下陰生藥用植物，生產(chǎn)中需要選擇具有合適郁閉度的林下環(huán)境種植[8]。喜光植物具有較高的光飽和點(diǎn)，全生育期都需要充足的光照，若生長(zhǎng)季節(jié)中光照不足，則會(huì)使植物生長(zhǎng)發(fā)育受到不同程度的影響。如：光照強(qiáng)度不足會(huì)降低高山紅景天根的生物量和紅景天苷的含量[9]；在曼陀羅及紫花曼陀羅植株中，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，其莖內(nèi)的花色素苷、類黃酮以及總酚等次生代謝產(chǎn)物的積累量也會(huì)相應(yīng)增加[10]。耐陰植物的光飽和點(diǎn)較低，在較低的光照強(qiáng)度下即可達(dá)到光飽和點(diǎn)，弱光下比強(qiáng)光下生長(zhǎng)好。低光照強(qiáng)度有利于石斛株高和可溶性蛋白含量的增加[11]。光照強(qiáng)度不僅能夠顯著改變?nèi)~片中關(guān)鍵藥用活性成分含量，對(duì)藥用植物葉片形態(tài)、生理和解剖結(jié)構(gòu)也有顯著的影響[12]。如：遮陰使芍藥的光合能力變差，花鮮質(zhì)量降低[13]；遮陰會(huì)使白三葉的光合速率降低，柵欄組織厚度變小，葉片變薄[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，遮陰后地黃的葉片變薄，葉肉細(xì)胞海綿組織和柵欄組織厚度均降低，葉片數(shù)減少，葉片泡狀凸起程度變?nèi)跎踔料Вf(shuō)明遮陰嚴(yán)重影響了地黃的葉片生長(zhǎng)和分化。但光照是如何調(diào)控地黃葉片發(fā)育及其內(nèi)在藥用成分合成機(jī)制目前并不清晰。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，遮陰對(duì)植物發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制研究已經(jīng)受到科研人員的關(guān)注。如：在玉米中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析就發(fā)現(xiàn)，遮陰能顯著影響葉片內(nèi)光合作用、激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)，其中，光合相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，而生長(zhǎng)素、赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，茉莉酸合成相關(guān)的基因則表達(dá)下降[15]。本研究中，在遮陰處理地黃葉內(nèi)所有參與光合的基因均下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明遮陰下地黃光合能力不足可能是地黃生長(zhǎng)不良的主要原因。同時(shí)，在遮陰地黃葉片中，與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切關(guān)聯(lián)的表達(dá)基因則顯著上調(diào)表達(dá)，這表明在遮陰處理下地黃通過(guò)提高生長(zhǎng)素早期應(yīng)答基因AUX1、AUX/IAA、ARF、CH3的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)遮陰脅迫。DELLA蛋白是赤霉素信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，DELLA下調(diào)表達(dá)可降低植物對(duì)GA的敏感性，加速植物莖的伸長(zhǎng)[16-17]。遮陰處理地黃體內(nèi)DELLA下調(diào)表達(dá)，與地黃莖伸長(zhǎng)增加變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明遮陰后通過(guò)降低DELLA的表達(dá)降低地黃對(duì)GA的敏感性。乙烯信號(hào)通路中，乙烯受體蛋白基因ETR下調(diào)表達(dá)，而CTR1上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明地黃通過(guò)降低ETR表達(dá)，并提高CTR1表達(dá)來(lái)抑制下游的乙烯響應(yīng)，以提升葉片對(duì)遮陰的適應(yīng)。

葉片除了是重要的光合器官外，也是藥用植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和貯藏的重要組織或藥用部位，前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)地黃葉片也含量有大量梓醇、毛蕊花糖苷等關(guān)鍵藥用活性成分。因此，藥用植物葉片為研究光照與藥用成分互作機(jī)制提供了良好基礎(chǔ)材料。光照強(qiáng)度還會(huì)影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累。如：強(qiáng)光有利于喜光藥用植物高山紅景天景天苷的積累[9]，也有利于曼陀羅莖花色素苷、類黃酮及總酚的積累[10]，但不利于耐陰藥用植物石斛可溶性蛋白的積累[11]。遮陰后，葡萄皮中的花色苷含量降低，參與花色苷合成的催化酶基因表達(dá)量也顯著降低[18]。梓醇和毛蕊花糖苷在地黃塊根和葉片中均有較高的含量，是《中華人民共和國(guó)藥典》中地黃質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。本研究發(fā)現(xiàn)參與梓醇生物合成的絕大多數(shù)催化酶基因在遮陰后呈下調(diào)表達(dá)，尤其是催化梓醇合成最后一步反應(yīng)的鯊烯單加氧酶基因SQM表達(dá)量下調(diào)，與遮陰后梓醇含量下降的變化趨勢(shì)一致。本課題組前期完善了毛蕊花糖苷生物合成的代謝通路，克隆了部分催化酶基因[19-20]。這些催化酶基因中有10個(gè)在遮陰處理后出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，有4個(gè)4-香豆素輔酶A連接酶基因和1個(gè)多酚氧化酶基因下調(diào)表達(dá)，表明遮陰同時(shí)也影響了毛蕊花糖苷的 代謝，但這種影響作用可能更為復(fù)雜?？傊?，本研究初步揭示了光照可能通過(guò)生長(zhǎng)素、乙烯等激素響應(yīng)調(diào)控了葉片的耐陰適應(yīng)性，同時(shí)，光照強(qiáng)度影響了梓醇等地黃關(guān)鍵藥用成分關(guān)鍵催化酶基因的轉(zhuǎn)錄變化，本研究為進(jìn)一步揭示地黃光照強(qiáng)度響應(yīng)機(jī)制和藥用成分合成機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。