工程酵母INVSC1與H1246的生長與目標化合物積累的比較

李 宏，劉萌萌，唐中偉，李友蓮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

隨著基因組學和代謝工程技術的不斷發(fā)展，各種代謝途徑的關鍵酶基因得到廣泛的研究，相關的工程酵母也逐漸被大家關注。酵母與動物、植物都為真核生物，具有生長繁殖較快、代謝周期較短、容易分離和培養(yǎng)等特點，可廣泛應用于構建真核生物模型，研究相關目的基因的功能等。釀酒酵母是單細胞真核微生物，屬于酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母種（Saccharomyces cerevisiae）。工程酵母INVSC1就是釀酒酵母中的一個重要代表種，又稱釀酒酵母INVSC1（CerevisiaeINVSC1），它生長繁殖較快，代謝周期較短，發(fā)酵工藝簡單，成本低廉，容易分離和培養(yǎng)，而且全基因組比較小，遺傳代謝背景比較清楚，具有完整的亞細胞結構和控制嚴密的基因表達調(diào)控系統(tǒng)機制，是外源基因[1]表達最為理想的真核生物表達系統(tǒng)，由于易于對其基因組進行連鎖分析、分子克隆及序列檢測等，所以，還可廣泛應用于構建真核生物模型和繪制更加詳細而精準的遺傳譜圖，為人類的遺傳疾病治療和檢測水平提供強有力的支撐。

油脂是高級脂肪酸與甘油形成的酯，即三脂酰甘油（TAG）。三脂酰甘油的生物合成途徑主要是甘油-3-磷酸（Gly3P）和脂酰輔酶A（acyl-CoA）為前體并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?；D移酶作用下通過多步生物反應合成的。其最后一步反應在二脂酰甘油?；D移酶（DGAT）作用下形成。三脂酰甘油還可由PDAT途徑合成，即磷脂和二酰甘油在磷脂二酰甘油?；D移酶（PDAT）的作用下反應生成TAG和溶血磷脂[2-3]。

H1246是酵母突變體TAG缺陷型的酵母菌株，該菌株中調(diào)控編碼TAG合成的DGA1（編碼DGAT）、LRO1基因（編碼PDAT）以及ARE1和ARE2基因（編碼膽固醇脂的合成）均已被敲除，可用于鑒定植物、動物和微藻等真核生物三脂酰甘油（TAG）合成途徑中DGAT或PDAT的活性[4-5]。三脂酰甘油（TAG）可以由DGAT和PDAT途徑合成[6]，由于H1246是TAG缺陷型酵母菌株，因而，不能通過上述途徑合成和積累TAG。而工程酵母INVSC1是正常型的酵母菌株，可以合成和積累TAG，用來驗證相關目的基因的功能等。

近年來，在工程酵母的研究與應用方面取得了長足的進展。如趙偉軍[7]利用代謝工程技術對工業(yè)釀酒酵母菌株合成S-腺苷蛋氨酸（SAM）的代謝網(wǎng)絡進行優(yōu)化和改造，大幅度提高了該工業(yè)菌株生產(chǎn)SAM的能力；傅盈盈等[8]以油菜菌核病原菌為試驗病菌，工程酵母INVSC1在溫度28℃條件下培養(yǎng)繁殖20 h后，經(jīng)測定，當接種量為5% 時，INVSC1對油菜菌核病原菌的抑菌效果最好；李媛等[9]通過對釀酒酵母基因工程菌的構建和工藝優(yōu)化的研究以及加強對細胞代謝工程、基因組學、蛋白組學的商討，從而獲取了更多酵母的相關基因信息；王珍[10]通過對圓紅冬孢酵母細胞內(nèi)的DGAT基因進行鑒定和功能性分析，確定了產(chǎn)油酵母圓紅冬孢酵母中只有RtDGATb具有DGAT的活性，并和油脂積累相關聯(lián)，是調(diào)控油脂積累過程中的關鍵因素。這些成果為工程酵母各個方面的研究奠定了基礎。

本研究以工程酵母INVSC1和H1246為研究材料，通過培養(yǎng)并測定INVSC1與H1246的生長曲線，經(jīng)尼羅紅染色、蘇丹黑染色、總脂肪酸含量測定、脂肪酸分析及薄層色譜分析等研究，分析工程酵母INVSC1與H1246的生長狀況及目標化合物積累情況，旨在為后期油脂代謝相關基因功能驗證等分子生物學試驗提供基礎，同時為酵母互補試驗提供一定的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試工程酵母INVSC1和H1246由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長趨勢測定

1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制及接種 分別稱取4 g酵母膏、8 g蛋白胨、8 g無水葡萄糖于1 000 mL容量瓶中，向容量瓶中加入400 mL蒸餾水，振蕩使其混合均勻制備為YPD液體培養(yǎng)基。將液體培養(yǎng)基于滅菌鍋高溫（120℃）高壓（33.78 kPa）中滅菌20 min。在已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中分別接入20μL工程酵母INVSC1和H1246菌種。

1.2.1.2 菌液濃度的測定 將接完菌的液體培養(yǎng)基于溫度30℃、轉速180 r/min的空氣浴振蕩器中振蕩，每2 h用移液槍分別吸取工程酵母INVSC1和H1246的培養(yǎng)基液體3 mL于2個比色皿中，以未接種酵母的YPD液體培養(yǎng)基作為對照，用紫外可見分光光度計測量其吸光度[11]并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼羅紅染色[12]觀察 將INVSC1與H1246的菌液離心并將二者菌株匯集起來，蒸餾水洗滌二者的沉淀，稀釋菌體沉淀，將菌液OD600調(diào)整至0.2～0.3（菌液濃度過高影響染色效果）。分別向菌液中依次加入菌液100μL、蒸餾水850μL、二甲基亞砜（DMSO）50μL、尼羅紅染液（5 mg/mL）10μL，強烈振蕩混合均勻5 s，避光染色1 min，用熒光相差顯微鏡觀察藍色激發(fā)光下酵母的染色情況，并記錄結果。

1.2.3 酵母中性油脂的檢測 將INVSC1與H1246的菌液離心并將二者菌株收集起來，然后用蒸餾水洗滌二者的沉淀，并將菌體沉淀稀釋，將菌液OD600調(diào)整至0.4～0.5。用無菌水重懸菌體沉淀，混合均勻后5 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，分別向INVSC1與H1246的離心管中加入3 mL 0.3% 的蘇丹黑[13-14]染液，染色15 min后于8 000 r/min下離心3 min后去掉上清液，分別向離心管中加入10 mL 70% 的酒精溶液混合均勻后離心去掉上清液，重復3次。用無菌水重懸菌體沉淀測OD580值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 工程酵母INVSC1和H1246目標化合物的提取與分析

1.2.4.1 總脂肪酸的提取 分別稱取50 mg充分研磨的工程酵母INVSC1與H1246酵母粉末于50 mL離心管中，加入7.5 mL的氯仿-甲醇（體積比為1∶2）混合溶劑，將離心管置于溫度37℃、轉速200 r/min的空氣浴振蕩器中抽提24 h。離心后收集上層有機相，向剩余的樣品殘渣再加入7.5 mL的氯仿-甲醇（體積比為1∶2）混合溶劑重復抽提12 h，并離心收集上層有機相，抽提3次并合并有機相。向收集上層有機相的離心管中加入5 mL氯仿溶液，9 mL 1% 的氯化鈉溶液，混合均勻后8 000 r/min離心10 min，收集下層有機相到已經(jīng)稱質(zhì)量的指形管中，水浴鍋加熱至有機相揮發(fā)并用烘箱烘干，冷卻至室溫后稱取指形管質(zhì)量，計算脂肪酸總量[15-17]。每組3次重復。

總脂肪酸含量＝（提取后總質(zhì)量－提取前管質(zhì)量）/酵母菌粉質(zhì)量 （1）

1.2.4.2 酵母脂肪酸成分分析 通過高速冷凍離心機將工程酵母INVSC1與H1246酵母冷凍24 h即可得到二者的干燥菌體。用分析天平分別稱取100 mg工程酵母INVSC1與H1246的干燥菌體并用液氮將其研磨成粉末，之后向工程酵母INVSC1與H1246中分別加入1.5 mL提取buffer（含2.5% 濃硫酸的甲醇，V/V），并且用水浴鍋80℃溫浴2 h，待二者冷卻至室溫后分別向其中加入2 mL 0.9% （V/V）氯化鈉和1 mL正己烷，輕輕振蕩混合均勻后在室溫條件下4 000 r/min離心10 min。取二者上清液并真空抽干，將沉淀用50μL乙酸乙酯溶解。在提取過程中加10μL C17∶0內(nèi)標。

通過GC System測定工程酵母INVSC1與H1246酵母的脂肪酸含量。色譜柱采用BPX-70柱，毛細柱采用30 mm×0.25 mm，設定GC的升溫程序：初始溫度設定為120℃并保持1 min，色譜柱的溫度以10℃/min的速率上升至150℃，然后再以4℃/min的速率讓色譜柱溫度上升至230℃并保持10 min。分別取其1μL樣品上樣后檢測其脂肪酸含量[18]。每組3次重復。

1.2.5 薄層色譜分析（TLC） 在硅膠板的下端1.5 cm處用毛細管依次均勻點上TAG標樣、工程酵母INVSC1和H1246總脂肪酸，點樣斑點直徑不大于0.5 cm，每樣間隔2.5 cm，待斑點溶劑揮發(fā)干后將硅膠板放入展開劑（按照正己烷∶乙醚∶甲酸＝40∶1∶1（體積比））飽和的層析缸中進行展開。當上行展開溶劑前沿距硅膠板上端約2 cm處時，將硅膠板取出并晾干[19]。等展開劑揮發(fā)后，將硅膠板放置于染色碘缸中進行染色，確定斑點位置。每組3次重復。

2 結果與分析

2.1 菌液濃度的測定結果

微生物生長曲線一般包括遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期3個階段。從圖1可以看出，工程酵母INVSC1與H1246的生長時期有著明顯的區(qū)別，INVSC1在0～8 h處于遲緩期，8～18 h處于對數(shù)期，18～28 h處于穩(wěn)定期；H1246在0～12 h處于遲緩期，12～22 h處于對數(shù)期，22～28 h處于穩(wěn)定期。由此可知，在相同的生長條件下，工程酵母INVSC1比H1246生長快，先進入對數(shù)生長期和穩(wěn)定期。此外，從圖1還可以看出，工程酵母生長的每個階段有不同的特點，遲緩期測定的濃度與剛開始時測定濃度一樣；對數(shù)期菌的生長速度大大加快，單位時間內(nèi)菌液的濃度增加量保持一致并達到最大值；穩(wěn)定期測定的菌液濃度增加量最小，基本上為0。

2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼羅紅染色觀察結果

從圖2可以看出，通過明場和熒光場的比較，工程酵母INVSC1經(jīng)過尼羅紅染色細胞呈橘紅色，內(nèi)部有明亮的油滴，因為尼羅紅會與中性油脂發(fā)生結合，并且在藍色激發(fā)光下發(fā)出熒光。而H1246經(jīng)過尼羅紅染色后細胞也呈橘紅色，但是內(nèi)部未見到油滴。

2.3 酵母中性油脂的檢測結果

經(jīng)蘇丹黑染色后工程酵母INVSC1與H1246中性油脂被染成了黑色，蘇丹黑附著在油脂上，故吸光度會提高。將2種酵母的初始懸浮液OD值都調(diào)至0.4左右，染色后，工程酵母INVSC1的OD580值明顯比H1246高，工程酵母INVSC1的OD580值在0.9左右，而H1246的OD580值在0.65左右（圖3）。

2.4 總脂肪酸的測定結果

2.4.1 脂肪酸的提取結果 由圖4可知，工程酵母INVSC1的總脂肪酸含量明顯比H1246的高，工程酵母INVSC1的總脂肪酸含量大約在20% 左右，而H1246的總脂肪酸含量大約在10% 左右。

2.4.2 酵母脂肪酸各成分分析 從圖5、6可以看出，工程酵母INVSC1含有3種不同的脂肪酸，H1246則含有2種不同的脂肪酸，而它們的目的峰分離效果較為明顯，基線也比較平穩(wěn)，沒有重疊和拖尾等現(xiàn)象，能夠準確判斷脂肪酸的類型及其相對含量，它們的出峰時間依次為C16∶0（棕櫚酸）、C16∶1（棕櫚油酸）、C18∶1（油酸）、C18∶2（亞油酸），每種脂肪酸所對應的峰面積越大，相對濃度越高，含量就越高[20]。

由表1和圖7可知，工程酵母INVSC1中棕櫚酸和油酸相對含量較高，而棕櫚油酸的相對含量非常低，幾乎沒有，所以，INVSC1中脂肪酸的主要成分是棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1），而H1246中棕櫚酸（C16∶0）和亞油酸（C18∶2）的含量很少，幾乎沒有。

表1酵母脂肪酸組分分析

2.5 薄層色譜分析（TLC）測定結果

由圖8可知，工程酵母INVSC1在硅膠板上有明顯的TAG，而H1246則沒有，即酵母INVSC1能正常合成積累TAG，而H1246則不能。

3 結論與討論

本研究通過培養(yǎng)工程酵母并測定其生長曲線，經(jīng)尼羅紅染色、蘇丹黑染色、總脂肪酸含量測定、酵母脂肪酸成分分析以及薄層色譜分析等一系列試驗，結果表明，在相同的生長條件下，工程酵母INVSC1合成的油脂多，H1246基本上不合成油脂，可以比較出正常酵母和缺陷酵母合成和積累油脂的能力，即正常酵母比缺陷酵母產(chǎn)油脂能力強，從而為后期油脂代謝相關基因功能驗證等分子生物學試驗提供研究材料和研究基礎。陽天泉等[3-4]在研究小桐子磷脂二酰甘油酰基轉移酶時，通過工程酵母的互補試驗得出，INVSC1能合成積累TAG，而H1246不能，且他在研究煙草二脂酰甘油?；D移酶基因時，通過TLC層析試驗、尼羅紅染色、酵母油脂含量試驗也得出了這個結論。譚太龍等[18]通過薄層色譜分析試驗研究得出，INVSC1能合成積累TAG，而H1246則不能。本試驗所獲得結果和前人的研究結果是一致的。

本研究還表明，工程酵母INVSC1與H1246的脂肪酸成分及含量也各不相同，可以提取不同的脂肪酸應用于分子生物學試驗、醫(yī)療保健、農(nóng)藥含量檢測等方面，為工程酵母INVSC1與H1246的進一步研究奠定研究基礎。