南北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜的研究

郭泰麟 李丹丹 張慧

【摘?要】?目的：采用HPLC-ELSD法分別建立南、北柴胡的指紋圖譜，并進(jìn)行真?zhèn)舞b別。 方法：樣品的甲醇提取液采用TOSOH TSKgel ODS-100V C18（4.6mm×15cm，5μm）色譜柱分析，乙腈-水梯度洗脫，流速：1.0 mL/min柱溫：25 ℃，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。并對結(jié)果進(jìn)行相似度評價(jià)和主成分分析。 結(jié)果：建立了含有11個(gè)共有峰的北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜和含有14個(gè)共有峰的南柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜。偽品的相似度低，可以通過指紋圖譜進(jìn)行真?zhèn)舞b別。 結(jié)論：該方法能快速可靠的鑒別和區(qū)分南、北柴胡，可以用于柴胡的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】?柴胡;狹葉柴胡;HPLC-ELSD;指紋圖譜

【中圖分類號】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A?【文章編號】1007-8517（2020）6-0019-06

Abstract：Objective AIM The fingerprints of Bupleurum chinense DC. and Bupleurum scorzonerifolium Willd. were established by HPLC-ELSD method， and to study their identification. METHODS The methanol extract of samples was performed on 25 ℃ themostatic TOSOH TSKgel ODS-100V C18 column（4.6mm×15cm，5μm） with mobile phase consisted of acetonitrile- water at the flow rate of 1 mL/min. The detector is ELSD. The results were analyzed by similarity and principal component analysis. RESULTS The HPLC-ELSD fingerprints of Bupleurum chinense DC. with 11 common peaks and the HPLC-ELSD fingerprints of Bupleurum scorzonerifolium Willd. with 14 common peaks were established. The counterfeits have low similarity， so it can be identified by HPLC-ELSD fingerprints.?CONCLUSIONS This method can quickly and reliably identify and distinguish B. chinense DC. and B. scorzonerifolium Willd.， and can be used for the quality control of Bupleuri Radix.

Key?words：Bupleurum chinense DC.;Bupleurum scorzonerifolium Willd.; HPLC-ELSD;Fingerprints

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）的干燥根[1]，習(xí)稱北柴胡和南柴胡。原名茈胡，又名山菜、地薰、茹草等[2]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗炎、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]。柴胡作為臨床常用藥物，在解熱和保肝方面用量大。但近年來由于北柴胡野生來源逐漸消失，南柴胡的野生資源基本絕種，市面上常見的南、北柴胡的來源均為人工種植。資源匱乏導(dǎo)致柴胡的價(jià)格逐漸上漲，市場內(nèi)偶見使用偽品和正品摻在一起進(jìn)行銷售的現(xiàn)象。市場上常見的偽品有：蒼蠅花的根[6]、陸地棉的根、野棉花的根[7]、尋骨風(fēng)的根[8]。所以柴胡的質(zhì)量研究逐漸成為熱點(diǎn)問題。北柴胡的主產(chǎn)地在山西、陜西、遼寧等省;南柴胡的主產(chǎn)地在陜西、內(nèi)蒙古、山西、甘肅等地。因此，藥材質(zhì)量的一致性問題也成為臨床用藥選購的重要依據(jù)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中對于柴胡指紋圖譜的建立大多使用VWD或DAD檢測器[9-11]，使用ELSD檢測器同時(shí)建立南、北柴胡指紋圖譜的少見報(bào)道。基于此類問題，為保證柴胡質(zhì)量一致性、解決用藥混亂的問題，本實(shí)驗(yàn)對來自不同產(chǎn)地的24批北柴胡和5批南柴胡及其4種偽品通過HPLC-ELSD法分別建立指紋圖譜，鑒定共有指紋峰，分別對不同產(chǎn)地的南北柴胡進(jìn)行化學(xué)成分一致性的評價(jià)，旨在對柴胡藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1?材料

1.1?儀器?Agilent1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies， Santa Clara， California， USA）;安捷倫G6240B蒸發(fā)光散射檢測器（Agilent Technologies， Santa Clara， California， USA）;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;LFP-800T高速多功能粉碎機(jī);JD200-3千分之一天平（沈陽龍騰電子有限公司）;Sartourius CP225D 十萬分之一天平。

1.2?試劑?甲醇、乙醇為色譜純（Merck KGaA， 62471 Darmstadt， Germancy），娃哈哈純凈水，對照品柴胡皂苷a（批號：P03M9F50593）購自上海源葉生物科技有限公司，柴胡皂苷d（批號：PS101397）、柴胡皂苷c（批號：PS000193）、柴胡皂苷f（批號：PS000195）均購自成都普斯生物科技股份有限公司。

1.3?藥材?實(shí)驗(yàn)中所用到24批北柴胡（1-24）、5批南柴胡（25～29）和4批偽品（30～33）收集于全國各地的藥材市場，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張慧教授鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）及狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）的根。具體樣品信息見表1和表2。

2?方法

2.1?色譜條件?TOSOH TSKgel ODS-100V 色譜柱（4.6mm×150cm，5μm）;乙腈（A）和水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～15min： 20%～30% A， 15～20min： 30%～35% A，20～35min： 35%～40% A，35～70min： 40%～70%?A，70～80min： 70%～75%?A，80～85min： 75%～90%?A， 85～90min： 90%～100%?A。流速：1mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20μL。蒸發(fā)器溫度：30℃;霧化器溫度：40℃;氣體流速：1.6mL/min。

2.2?溶液的制備?取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f適量，精密稱定，分別置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至容量瓶刻度線。制成柴胡皂苷a?0.401mg/mL、柴胡皂苷d?0.415 mg/mL、柴胡皂苷c?0.419 mg/mL、柴胡皂苷f?0.451 mg/mL的對照品溶液。

2.3?供試品的制備?取本品粉末（過65目篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，向內(nèi)加入含10%濃氨試液的甲醇液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40min，濾過，使用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液和濾液合并，在60 ℃回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，使用甲醇定容至容量瓶刻度線，搖勻后過0.45μm濾，得供試品溶液。

2.4?方法學(xué)考察

2.4.1?穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)?精密稱取柴胡8號樣品0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法分別于0、2、4、6、8、12 h間隔進(jìn)樣。以柴胡皂苷d的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于1.03%和2.06%。表明本方法精密度良好。

2.4.2?精密度實(shí)驗(yàn)?精密稱取柴胡8號樣品0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法，連續(xù)測定6次。以柴胡皂苷d的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于1.57%和2.22%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.4.3?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)?精密稱取6份同樣的柴胡8號樣品各0.5 g，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法，進(jìn)樣分析。以柴胡皂苷d的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于2.15%和1.53%，說明該方法重復(fù)性良好。

3?結(jié)果

3.1?指紋圖譜的建立?取24批北柴胡和5批南柴胡樣品適量， 按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 版）分別對24批北柴胡和5批南柴胡樣品進(jìn)行指紋圖譜的分析。以陜西寶雞野生北柴胡（S4）為參照色譜，生成北柴胡的對照指紋圖譜（圖1）;以山東臨沂產(chǎn)南柴胡（S27）為參照，生成南柴胡的對照指紋圖譜（圖2）。結(jié)果在北柴胡的指紋圖譜中共得到11個(gè)共有峰，南柴胡的指紋圖譜上得到14個(gè)共有峰。共有峰面積均占指紋圖譜峰面積的90%以上，北柴胡指紋圖譜詳見圖3，南柴胡的指紋圖譜詳見圖4。

3.2?指紋峰的鑒定?經(jīng)查閱文獻(xiàn)和與對照品圖譜的比對，在南、北柴胡指紋圖譜中定出5個(gè)成分的結(jié)構(gòu)，分別是柴胡皂苷c（1號峰） ，柴胡皂苷f（2號峰），柴胡皂苷a（3號峰），柴胡皂苷e（4號峰），柴胡皂苷d（5號峰）。

3.3?真?zhèn)舞b別?通過將不同產(chǎn)地的南、北的對照指紋圖譜及其偽品的指紋圖譜（圖5）相比較，二者之間具有顯著性差異。其中蒼蠅花根（S30）、棉花根（S31）和尋骨風(fēng)根（S32）在色譜圖前76分鐘中幾乎無色譜峰，而野棉花根（S33）的色譜峰跟其余三種偽品差別非常明顯。并且四種偽品和正品柴胡的指紋相似度依次為：蒼蠅花根（0.0710）、棉花根（0.257）、野棉花根（0.213）、尋骨風(fēng)根（0.0801）。柴胡及其偽品的指紋圖譜差異較大，所以根據(jù)HPLC-ELSD方法建立的南、北柴胡指紋圖譜可以對柴胡的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。

3.4?柴胡指紋圖譜相似度評價(jià)?采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 版）對24批北柴胡、5批南柴胡指紋圖譜進(jìn)行處理，以陜西寶雞野生北柴胡（S4）為參照，計(jì)算11個(gè)共有峰的保留時(shí)間的相似度;以山東臨沂產(chǎn)南柴胡（S27）為參照，計(jì)算14個(gè)共有峰的保留時(shí)間的相似度。結(jié)果表明，以柴胡皂苷d為參照峰，24批北柴胡、5批南柴胡各個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD為2.51%和3.70%，差異性較小，北柴胡相似度在0.722～0.950之間，南柴胡相似度在0.767～0.927，表明不同產(chǎn)地的南北柴胡均具有一致性，不同產(chǎn)地的北柴胡相似度測定結(jié)果見表3，南柴胡相似度見表4。

3.5?主成分分析

3.5.1?北柴胡的主成分的分析?以北柴胡的HPLC-ELSD指紋圖譜中的11個(gè)共有峰峰面積為變量，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行主成分分析。將特征值及貢獻(xiàn)率作為依據(jù)，根據(jù)載荷量計(jì)算綜合得分。北柴胡的主成分特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果見表5。北柴胡中選出了3種主成分，因?yàn)檫@三種主成分對應(yīng)的特征值大于1。3種主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了78.3%，說明了這3種主成分可以作為北柴胡質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)。其中主成分1中系數(shù)較大的是X2、X3、X4、X5;主成分2中系數(shù)較大的是X7、X9、X11;主成分3中系數(shù)較大的是X8;說明3個(gè)主成分中的8個(gè)共有峰對北柴胡質(zhì)量評價(jià)貢獻(xiàn)率較大，表明這8個(gè)共有峰對24批北柴胡的質(zhì)量影響較大。

3.5.2?南柴胡的主成分分析?以南柴胡的HPLC-ELSD的指紋圖譜中的14個(gè)共有峰峰面積為變量，根據(jù)載荷圖計(jì)算綜合得分。南柴胡的主成分特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果見表6。南柴胡中選出4種主成分，4種主成份的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了100%，說明了這4種主成分可以作為南柴胡質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)。其中主成分1中系數(shù)較大的是X1、X2、X5、X6、X7、X10;主成分2中系數(shù)較大的是X4;說明2個(gè)主成分中的7個(gè)共有峰對南柴胡質(zhì)量評價(jià)貢獻(xiàn)率較大，表明這7個(gè)共有峰對5批北柴胡的質(zhì)量影響較大。

4?討論

本文建立了24批北柴胡、5批南柴胡和4批偽品的HPLC-ELSD指紋圖譜，北柴胡提取出11個(gè)共有峰，南柴胡提取出14個(gè)共有峰。利用中藥指紋相似度評價(jià)軟件南北柴胡進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果顯示，24批北柴胡相似度為0.722～0.950之間;5批南柴胡的相似度為0.767～0.927之間。表明了不同產(chǎn)地的柴胡具有成分的相似性。同時(shí)對柴胡的4種偽品進(jìn)行了真?zhèn)舞b別，相似度分別為0.0710、0.257、0.213、0.0801。偽品和正品柴胡的相似度差異性大，這表明建立的指紋圖譜可以對柴胡的偽品進(jìn)行鑒別。

通過SPSS主成分分析的結(jié)果得出，影響北柴胡質(zhì)量的差異性成分有8個(gè)，影響南柴胡質(zhì)量差異性成分有7個(gè)。在偽品中并未檢測到這些成分，說明通過SPSS得出的質(zhì)量差異性成分同樣可以對南北柴胡的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。并且通過對照品的指認(rèn)和查閱文獻(xiàn)，從這些差異性成分中鑒定出了5種成分，X1為柴胡皂苷c，X2為柴胡皂苷f，X3為柴胡皂苷a，X4為柴胡皂苷e，X5為柴胡皂苷d。在南北柴胡中這五種成分都存在。X2、X3、X4、X5這四種成分對北柴胡的質(zhì)量影響較大，X1、X2、X4、X5這四種成分對南柴胡的質(zhì)量影響較大。

綜上所述，本研究建立的南、北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜及主成分分析得出的影響南北柴胡的質(zhì)量差異性成分，可以為柴胡的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供參考。

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（收稿日期：2019-12-04?編輯：劉斌）